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摘要：目的 观察葛根素（Pue）对IL-1β损伤大鼠关节软骨细胞一氧化氮的影响。 方法 取雌性10日龄大鼠膝关节软骨作体外细胞培养，培养后软骨细胞随机分成正常组、L-1β组、地塞米松组、Pue50组、Pue100组、Pue200组等6组。后5组分别加入IL-1β（5 μg/L）10 μmol、IL-1β（5 μg/L）10 μmol +地塞米松10-9 mol、IL-1β（5 μg/L）10 μmol +Pue50 μmol/L、IL-1β（5 μg/L）10 μmol+ Pue100 μmol/L、IL-1β（5 μg/L）10 μmol+Pue200 μmol/L，使用南京建成生物工程研究所的一氧化氮（NO）试剂盒和一氧化氮合成酶（iNOS）试剂盒检测NO含量和iNOS活性。 结果 6组软骨细胞的NO含量（μmol/L）分别为1.351、12.162、4.054、9.459、6.757、5.405，后4组与IL-1β组比较有明显差异（P<0.05），且随着剂量上升（50、100、200 μmol/L），软骨细胞分泌的NO的含量越少。6组软骨细胞的iNOS含量（U/mL）分别为0.535、1.069、0.713、1.069、0.891、0.713，后4组与IL-1β组比较有明显差异（P<0.05），且随着剂量上升（50、100、200 μmol/L），iNOS活性越低。 结论 葛根素是一良好的NO清除剂，其通过降低iNOS活性，减少NO生成，以达到保护关节软骨细胞的目的，为防止骨性关节炎提供理论依据。
关键词：葛根素；软骨细胞；IL-1β；iNOS活性；NO含量
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2017）02-0083-03
【Abstract】Objective： To observe the effect of puerarin on nitric oxide （NO） of articular chondrocytes in rats with IL-1β-induced injury. Methods： Chondrocytes were isolated from female 10-day-old rats and cultured in vitro. The chondrocytes were randomly divided into a normal group， a L-1β group， a dexamethasone group， a Pue50 group， a Pue100 group and a Pue200 group. The latter five groups were respectively given （5 μg/L） 10 μmol， IL-1 β （5 μg/L） 10 μmol+dexamethasone 10 μmol， IL-1 β （5 μg/L） 10 μmol/L， 10 μmol+Pue 100 μmol/L and 10 μmol+Pue 200 μmol/L of IL-1β （5 μg/L） and NO kit and iNOS kit made by Nanjing Jiancheng Biology Engineering Institute were used to detect NO content and iNOS activity. Results： The NO content （μmol/L） of chondrocytes of the six groups was 1.351， 12.162， 4.054， 9. 459， 6.757 and 5. 405 respectively. There were significant differences between the latter four groups and IL-1β group （P<0.05） （50 μmol/L， 100 μmol/L， 200 μmol/L）. With the rising of dose（50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L）， the content of NO produced by chondrocytes decreased. The iNOS content （U/mL） of the six groups of chondrocytes was 0.535， 1.069， 0.713， 1. 069， 0.891and 0.713 respectively. The iNOS content of the latter four groups were significantly different from those of IL-1β group （P<0.05）. With the rising of the dose （50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L）， the activity of iNOS became lower. Conclusion： Puerarin is a good NO scavenger， which can protect the articular chondrocytes by lowering iNOS activity and decreasing NO production， which provides a theoretical basis for preventing osteoarthritis.
【Key words】puerarin， chondrocyte， IL-1β， iNOS activity， NO content
骨性關节炎（OA）是一种常见的，以关节软骨变性为其特征的慢性骨关节病。研究表明OA时关节软骨细胞及滑膜内一氧化氮（NO）水平明显升高[1]，NO通过抑制关节软骨细胞蛋白多糖的合成，导致关节软骨逐渐粗糙而发生退变[2]。NO是由一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase，NOS）催化生成的，而其中诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）与OA关系密切。iNOS表达较高时则能催化NO水平持续升高。葛根素（Puerarin，Pue）是中药葛根的提取物，也是葛根的主要有效成份之一，在上一部分实验中证实葛根素可以保护IL-1β损伤的软骨细胞，并促进其增殖。现在笔者根据葛根素的作用和OA的发病机制，来探讨葛根素对IL-1β损伤软骨细胞的作用机制：可能是通过降低iNOS活性从而减少NO的合成来达成的。 1 材料与方法
1.1 主要材料及设备 SPF级10日龄大鼠（武汉同济医学院实验动物中心提供）、CO2恒温培养箱（日本SANYO公司）、超净工作台（苏净安泰）、生物倒置显微镜（重庆光电仪器总公司）、752紫外分光光度计（上海民怡仪器仪表有限公司）、台式离心机（Heal Force）、微型漩涡混合器（上海凌仪实业有限公司）、恒温水浴锅（武汉金宝华科技有限公司）、移液枪（上海佳安分析仪器厂）。
1.2 主要试剂 DMEM/F12培养基（美国Hyclone公司）、胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）、胰蛋白酶（Amresco公司）、II型胶原酶（北京博奥森生物技术有限公司）、重组大鼠白介素-1β（rratIL-1β，PeproTech公司）、地塞米松磷酸钠注射液（Solarbio公司）、葛根素标准品（Sigma公司）、无钙镁磷酸缓冲液（PBS）、一氧化氮试剂盒（南京建成生物工程研究所）、诱导型一氧化氮合成酶（南京建成生物工程研究所）。
1.3 软骨细胞的原代培养及传代 取SPF级10日龄大鼠，脱颈处死后，在无菌条件下取出髋膝关节处的软骨组织块，于超净工作台内置入含10%双抗的PBS培养皿中，清洗一遍，再用不含双抗的PBs清洗三遍。然后将软骨组织块移入EP管，向EP管中滴入2-3滴PBS，然后用眼科剪将组织块剪至约1 mm3大小。将EP管中的PBS吸出，加入0.2%Ⅱ型胶原酶使组织块处于悬浮状态，置于37℃条件下消化过夜。消化完成后，将EP管在振荡器上振荡2 min，使消化下来的细胞从组织中离散。离心弃上清，取出下层细胞加入盛10%胎牛血清的DMEM/F12培养瓶中，置于37℃、5% CO2恒温培养箱中培养。72 h后更换培养液，观察细胞生长情况，以后隔2天更换1次培养液，当细胞长满单层的80%-90%左右后进入传代培养。
达到传代条件后，将培养瓶中的培养液吸弃，用PBS冲洗2遍，加入0.25%胰蛋白酶2 mL消化5 min左右，在倒置显微镜下见细胞变圆后，立即弃去消化液终止消化，加入含血清的培养液冲洗、吹打，使细胞悬浮起来，根据需要调节细胞浓度分瓶接种于新的培养瓶中。置于37℃、5% CO2恒温培养箱中培养。
1.4 实验分组 ①正常软骨细胞组；②IL-1β组，按浓度5 μg/L加入IL-1β10 μmol；③IL-1β（5 μg/L）10 μmol +地塞米松（10-9 mol/L）；④、⑤、⑥IL-1β（5 μg/L）10 μmol +葛根素50、100、200 μmol/L。
1.5 实验方法 取生长良好的传代软骨细胞，用0.25%胰蛋白酶常规消化，用培养液配制成浓度为1×105个/mL的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔加200 μL，置于37℃，5% CO2恒温培养箱中。待培养24 h细胞贴壁后，分别加入含IL-1β和药物的培养基，共设6组，每组3孔。培养24 h后用南京建成生物工程研究所的NO试剂盒和iNOS试剂盒检测NO含量和iNOS活性，具体操作方法按试剂盒说明书进行。
1.6 统计学处理 所有数据均由SPSS 17.0软件进行处理，计量资料采用（x±s）表示，2组间比较采用两样本均数t检验，P<0.05差异有统计学意义。
2 结果
2.1 NO含量的检测 IL-1β能损伤软骨细胞，增加NO的释放量，同正常组比较有显著差异性（P<0.01）。地塞米松和葛根素均能显著减少NO的生成，而葛根素减少NO的生成呈剂量依赖性，剂量越高，分泌的NO越少，见表1。
2.2 iNOS活性的检测 IL-1β损伤软骨细胞后增强了iNOS的含量，同正常组相比差异有意义（P<0.05），地塞米松和葛根素均能顯著降低iNOS的含量（P<0.05），而葛根素降低iNOS的含量呈剂量依赖性，剂量越高，iNOS含量越低，表明葛根素能降低iNOS活性，同时葛根素剂量越高，iNOS活性越低，见表2。
3 讨论
骨性关节炎（OA）又称骨关节病、退行性关节病、老年性关节炎等，是一种常见的以关节疼痛、肿胀、僵硬和畸形为特点，以关节软骨变性为其特征的慢性骨关节病。我国正在进入老龄化社会，因而老年OA的发病率也呈逐年上升的趋势，是老年人关节疼痛和致残的主要原因[3]。一般认为OA是在力学和生物学等因素的共同作用下，由于软骨细胞、细胞外基质（ECG）及软骨下骨三者之间分解和合成代谢失衡，从而引起软骨损害、滑膜炎性改变为特点的疾病。本病发病核心是从关节软骨退行性改变逐步累及软骨下骨质、滑膜、关节囊等关节重要结构。其中关节软骨的退行性改变是骨性关节炎发病的病理基础和核心。关节软骨由较骨细胞和细胞外基质组成，几乎所有的致病因素均是通过影响这二者而致病的。近年发现，细胞因子、蛋白酶分泌异常，导致软骨退变，是骨性关节炎发病中心环节[4]。
一氧化氮（nitric oxide，NO）作为一种气体自由基，其产生路径有很多，其能对细菌和肿瘤细胞产生杀伤作用，同时正常组织也能被NO刺激而造成损伤[5]。骨性关节炎时关节软骨会产生大量的NO，而NO会对软骨产生有害作用，主要表现于对蛋白多糖和Ⅱ型胶原合成与分泌的抑制。NO是由一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase，NOS）催化生成的，而NOS可以分为三种，分别是诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）、内皮型一氧化氮合成酶（eNOS）和神经元型一氧化氮合成酶（nNOS），其中iNOS与OA关系密切。Amin等在OA患者的关节软骨细胞中发现iNOS高表达，认为iNOS是由特定细胞因子诱导合成的，如IL-1β、肿瘤坏死因子、和γ-干扰素等[6]。iNOS表达较高时则能催化NO水平持续升高，而NO通过抑制关节软骨细胞蛋白多糖的合成，造成软骨损伤，最终导致OA的发生[7]。
笔者在试验发现，软骨细胞在受到IL-1β刺激后iN0S活性增强，NO生成大量增加，印证了前期的实验研究。本实验证实IL-1β损伤的大鼠关节软骨细胞N0生成远远超过正常组，iNOS生成也远远超过正常组，反映了NO体系在受到IL-1β刺激后的连锁反应，结合前一实验中IL-1β损伤组软骨细胞增殖率的降低，印证了NO体系受到IL-1β刺激后发生连锁性的反应，通过NO损伤软骨细胞。由实验结果可以看出，地塞米松和葛根素在一定范围内都有清除N0、降低iNOS活性的效应，而葛根素保护效应呈明显的剂量依赖性。在本实验中，葛根素作为良好的NO清除剂，其通过降低iNOS活性，减少NO生成，以达到保护软骨细胞的目的，为葛根素的临床应用提供了理论依据。
参考文献：
[1]王林，王大寿，穆琼，等.臭氧治疗对家兔骨性关节炎病变及NO含量的影响[J].贵阳医学院学报，2010，35（4）：349-351.
[2]王声.一氧化氮合成酶在骨关节炎研究中的新进展[J].中国现代药物应用，2012，6（19）：117.
[3]赵锦松，李小霞.骨性关节炎的临床表现与诊断[J].解放军保健医学杂志，2005，3（7）：135-137.
[4]Yu LP Jr，Smith GN Jr，Hasty KA，et al.Doxycycline inhibits type Ⅺ collagenolytic activity of extracts from human osteoarthritic cartilage and of gelatinase[J].Rheumatol，1991，18：1450-1452.
[5]Moilanen E.Nitric oxide in inflammation and immune response[J].Ann Med，1995，27：359-367.
[6]Amin AR，di Cesare PE，Vyas P，et al.The expression and regulation of nitric oxide synthase in human osteoarthritis-affected chondrocytes：evidence for up-regulated neuronal nitric oxide synthase[J].Exp Med.1995，182：2097-2102.
[7]李勇光，郑婧，高宇，等.臭氧对骨性关节炎实验兔软骨细胞iNOS及MMP-1表达的影响[J].中华物理医学与康复杂志，2012，34（6）：472-473.
（收稿日期：2016-09-18）
关键词：葛根素；软骨细胞；IL-1β；iNOS活性；NO含量
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2017）02-0083-03
【Abstract】Objective： To observe the effect of puerarin on nitric oxide （NO） of articular chondrocytes in rats with IL-1β-induced injury. Methods： Chondrocytes were isolated from female 10-day-old rats and cultured in vitro. The chondrocytes were randomly divided into a normal group， a L-1β group， a dexamethasone group， a Pue50 group， a Pue100 group and a Pue200 group. The latter five groups were respectively given （5 μg/L） 10 μmol， IL-1 β （5 μg/L） 10 μmol+dexamethasone 10 μmol， IL-1 β （5 μg/L） 10 μmol/L， 10 μmol+Pue 100 μmol/L and 10 μmol+Pue 200 μmol/L of IL-1β （5 μg/L） and NO kit and iNOS kit made by Nanjing Jiancheng Biology Engineering Institute were used to detect NO content and iNOS activity. Results： The NO content （μmol/L） of chondrocytes of the six groups was 1.351， 12.162， 4.054， 9. 459， 6.757 and 5. 405 respectively. There were significant differences between the latter four groups and IL-1β group （P<0.05） （50 μmol/L， 100 μmol/L， 200 μmol/L）. With the rising of dose（50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L）， the content of NO produced by chondrocytes decreased. The iNOS content （U/mL） of the six groups of chondrocytes was 0.535， 1.069， 0.713， 1. 069， 0.891and 0.713 respectively. The iNOS content of the latter four groups were significantly different from those of IL-1β group （P<0.05）. With the rising of the dose （50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L）， the activity of iNOS became lower. Conclusion： Puerarin is a good NO scavenger， which can protect the articular chondrocytes by lowering iNOS activity and decreasing NO production， which provides a theoretical basis for preventing osteoarthritis.
【Key words】puerarin， chondrocyte， IL-1β， iNOS activity， NO content
骨性關节炎（OA）是一种常见的，以关节软骨变性为其特征的慢性骨关节病。研究表明OA时关节软骨细胞及滑膜内一氧化氮（NO）水平明显升高[1]，NO通过抑制关节软骨细胞蛋白多糖的合成，导致关节软骨逐渐粗糙而发生退变[2]。NO是由一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase，NOS）催化生成的，而其中诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）与OA关系密切。iNOS表达较高时则能催化NO水平持续升高。葛根素（Puerarin，Pue）是中药葛根的提取物，也是葛根的主要有效成份之一，在上一部分实验中证实葛根素可以保护IL-1β损伤的软骨细胞，并促进其增殖。现在笔者根据葛根素的作用和OA的发病机制，来探讨葛根素对IL-1β损伤软骨细胞的作用机制：可能是通过降低iNOS活性从而减少NO的合成来达成的。 1 材料与方法
1.1 主要材料及设备 SPF级10日龄大鼠（武汉同济医学院实验动物中心提供）、CO2恒温培养箱（日本SANYO公司）、超净工作台（苏净安泰）、生物倒置显微镜（重庆光电仪器总公司）、752紫外分光光度计（上海民怡仪器仪表有限公司）、台式离心机（Heal Force）、微型漩涡混合器（上海凌仪实业有限公司）、恒温水浴锅（武汉金宝华科技有限公司）、移液枪（上海佳安分析仪器厂）。
1.2 主要试剂 DMEM/F12培养基（美国Hyclone公司）、胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）、胰蛋白酶（Amresco公司）、II型胶原酶（北京博奥森生物技术有限公司）、重组大鼠白介素-1β（rratIL-1β，PeproTech公司）、地塞米松磷酸钠注射液（Solarbio公司）、葛根素标准品（Sigma公司）、无钙镁磷酸缓冲液（PBS）、一氧化氮试剂盒（南京建成生物工程研究所）、诱导型一氧化氮合成酶（南京建成生物工程研究所）。
1.3 软骨细胞的原代培养及传代 取SPF级10日龄大鼠，脱颈处死后，在无菌条件下取出髋膝关节处的软骨组织块，于超净工作台内置入含10%双抗的PBS培养皿中，清洗一遍，再用不含双抗的PBs清洗三遍。然后将软骨组织块移入EP管，向EP管中滴入2-3滴PBS，然后用眼科剪将组织块剪至约1 mm3大小。将EP管中的PBS吸出，加入0.2%Ⅱ型胶原酶使组织块处于悬浮状态，置于37℃条件下消化过夜。消化完成后，将EP管在振荡器上振荡2 min，使消化下来的细胞从组织中离散。离心弃上清，取出下层细胞加入盛10%胎牛血清的DMEM/F12培养瓶中，置于37℃、5% CO2恒温培养箱中培养。72 h后更换培养液，观察细胞生长情况，以后隔2天更换1次培养液，当细胞长满单层的80%-90%左右后进入传代培养。
达到传代条件后，将培养瓶中的培养液吸弃，用PBS冲洗2遍，加入0.25%胰蛋白酶2 mL消化5 min左右，在倒置显微镜下见细胞变圆后，立即弃去消化液终止消化，加入含血清的培养液冲洗、吹打，使细胞悬浮起来，根据需要调节细胞浓度分瓶接种于新的培养瓶中。置于37℃、5% CO2恒温培养箱中培养。
1.4 实验分组 ①正常软骨细胞组；②IL-1β组，按浓度5 μg/L加入IL-1β10 μmol；③IL-1β（5 μg/L）10 μmol +地塞米松（10-9 mol/L）；④、⑤、⑥IL-1β（5 μg/L）10 μmol +葛根素50、100、200 μmol/L。
1.5 实验方法 取生长良好的传代软骨细胞，用0.25%胰蛋白酶常规消化，用培养液配制成浓度为1×105个/mL的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔加200 μL，置于37℃，5% CO2恒温培养箱中。待培养24 h细胞贴壁后，分别加入含IL-1β和药物的培养基，共设6组，每组3孔。培养24 h后用南京建成生物工程研究所的NO试剂盒和iNOS试剂盒检测NO含量和iNOS活性，具体操作方法按试剂盒说明书进行。
1.6 统计学处理 所有数据均由SPSS 17.0软件进行处理，计量资料采用（x±s）表示，2组间比较采用两样本均数t检验，P<0.05差异有统计学意义。
2 结果
2.1 NO含量的检测 IL-1β能损伤软骨细胞，增加NO的释放量，同正常组比较有显著差异性（P<0.01）。地塞米松和葛根素均能显著减少NO的生成，而葛根素减少NO的生成呈剂量依赖性，剂量越高，分泌的NO越少，见表1。
2.2 iNOS活性的检测 IL-1β损伤软骨细胞后增强了iNOS的含量，同正常组相比差异有意义（P<0.05），地塞米松和葛根素均能顯著降低iNOS的含量（P<0.05），而葛根素降低iNOS的含量呈剂量依赖性，剂量越高，iNOS含量越低，表明葛根素能降低iNOS活性，同时葛根素剂量越高，iNOS活性越低，见表2。
3 讨论
骨性关节炎（OA）又称骨关节病、退行性关节病、老年性关节炎等，是一种常见的以关节疼痛、肿胀、僵硬和畸形为特点，以关节软骨变性为其特征的慢性骨关节病。我国正在进入老龄化社会，因而老年OA的发病率也呈逐年上升的趋势，是老年人关节疼痛和致残的主要原因[3]。一般认为OA是在力学和生物学等因素的共同作用下，由于软骨细胞、细胞外基质（ECG）及软骨下骨三者之间分解和合成代谢失衡，从而引起软骨损害、滑膜炎性改变为特点的疾病。本病发病核心是从关节软骨退行性改变逐步累及软骨下骨质、滑膜、关节囊等关节重要结构。其中关节软骨的退行性改变是骨性关节炎发病的病理基础和核心。关节软骨由较骨细胞和细胞外基质组成，几乎所有的致病因素均是通过影响这二者而致病的。近年发现，细胞因子、蛋白酶分泌异常，导致软骨退变，是骨性关节炎发病中心环节[4]。
一氧化氮（nitric oxide，NO）作为一种气体自由基，其产生路径有很多，其能对细菌和肿瘤细胞产生杀伤作用，同时正常组织也能被NO刺激而造成损伤[5]。骨性关节炎时关节软骨会产生大量的NO，而NO会对软骨产生有害作用，主要表现于对蛋白多糖和Ⅱ型胶原合成与分泌的抑制。NO是由一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase，NOS）催化生成的，而NOS可以分为三种，分别是诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）、内皮型一氧化氮合成酶（eNOS）和神经元型一氧化氮合成酶（nNOS），其中iNOS与OA关系密切。Amin等在OA患者的关节软骨细胞中发现iNOS高表达，认为iNOS是由特定细胞因子诱导合成的，如IL-1β、肿瘤坏死因子、和γ-干扰素等[6]。iNOS表达较高时则能催化NO水平持续升高，而NO通过抑制关节软骨细胞蛋白多糖的合成，造成软骨损伤，最终导致OA的发生[7]。
笔者在试验发现，软骨细胞在受到IL-1β刺激后iN0S活性增强，NO生成大量增加，印证了前期的实验研究。本实验证实IL-1β损伤的大鼠关节软骨细胞N0生成远远超过正常组，iNOS生成也远远超过正常组，反映了NO体系在受到IL-1β刺激后的连锁反应，结合前一实验中IL-1β损伤组软骨细胞增殖率的降低，印证了NO体系受到IL-1β刺激后发生连锁性的反应，通过NO损伤软骨细胞。由实验结果可以看出，地塞米松和葛根素在一定范围内都有清除N0、降低iNOS活性的效应，而葛根素保护效应呈明显的剂量依赖性。在本实验中，葛根素作为良好的NO清除剂，其通过降低iNOS活性，减少NO生成，以达到保护软骨细胞的目的，为葛根素的临床应用提供了理论依据。
参考文献：
[1]王林，王大寿，穆琼，等.臭氧治疗对家兔骨性关节炎病变及NO含量的影响[J].贵阳医学院学报，2010，35（4）：349-351.
[2]王声.一氧化氮合成酶在骨关节炎研究中的新进展[J].中国现代药物应用，2012，6（19）：117.
[3]赵锦松，李小霞.骨性关节炎的临床表现与诊断[J].解放军保健医学杂志，2005，3（7）：135-137.
[4]Yu LP Jr，Smith GN Jr，Hasty KA，et al.Doxycycline inhibits type Ⅺ collagenolytic activity of extracts from human osteoarthritic cartilage and of gelatinase[J].Rheumatol，1991，18：1450-1452.
[5]Moilanen E.Nitric oxide in inflammation and immune response[J].Ann Med，1995，27：359-367.
[6]Amin AR，di Cesare PE，Vyas P，et al.The expression and regulation of nitric oxide synthase in human osteoarthritis-affected chondrocytes：evidence for up-regulated neuronal nitric oxide synthase[J].Exp Med.1995，182：2097-2102.
[7]李勇光，郑婧，高宇，等.臭氧对骨性关节炎实验兔软骨细胞iNOS及MMP-1表达的影响[J].中华物理医学与康复杂志，2012，34（6）：472-473.
（收稿日期：2016-09-18）