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摘要 [目的]建立同时测定盐碱地种植的红白忍冬和金银花中新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、木犀草苷和木犀草素的HPLC方法，并比较不同植物器官中5种成分的含量。[方法]色谱柱为Inertsil ODS-SP C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为0.1%甲酸水溶液-乙腈；体积流量1.0 mL/min；检测波长327 nm；柱温30 ℃。[结果]新绿原酸、绿原酸在1.0～500.0 μg/mL，咖啡酸在0.2～100.0 μg/mL，木犀草苷、木犀草素在0.1～50.0 μg/mL具有良好的线性关系；5种成分的日内和日间精密度RSD值均≤4.2%，且在36 h 内稳定，平均回收率为95.60%～97.35%。红白忍冬和金银花药材样品中5种化合物的含量差异较显著，在各器官中金银花5种化合物均比红白忍冬高，但红白忍冬中5种化合物的含量亦有较高水平。[结论]该方法简单便捷，适合于红白忍冬中生物活性化合物的定量测定研究，能为该药材的质量控制制定提供科学、可靠的分析技术。
关键词 红白忍冬；金银花；新绿原酸；绿原酸；咖啡酸；木犀草苷；木犀草素；高效液相色谱；定量分析
中图分类号 R284 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）34-0126-02
Abstract [Objective] The research aimed to establish HPLC method for simultaneous determination of neochlorogenic acid，chlorogenic acid，cafferic acid，luteoloside and luteolin in L.japonica var.and L.japonica Thunb.cultivated in saline soil，and compare the contents of five components in different plant organs.[Method]The chromatographic column was Inertsil ODSSP C18 column （250 mm × 4.6 mm，5 μm）； the mobile phase was 0.1% formic acid aqueous solutionacetonitrile；volume flow rate was 1.0 mL/min； detection wavelength was 327 nm； column temperature was 30 ℃.[Result]Neochlorogenic acid and chlorogenic acid in 1.0 -500.0 μg/mL，caffeic acid in 0.2 - 100.0 μg/mL，luteoloside and luteolin in 0.1 - 50.0 μg/mL had a good linear relationship；The RSD values of the inter- and intra- precisions were less than 4.2%.The stability was accepted within 36 h.The average recovery rate were 95.60% -97.35%.The contents of five compounds in L.japonica Thunb.were higher than those in L.japonica var.，but the contents of five compounds in L.japonica var.was enough.[Conclusion]The method is simple and convenient，and is suitable for the quantitative determination of biologically active compounds in Lonicera japonica var..It can provide scientific and reliable analytical techniques for the quality control of the medicinal materials.
Key words Lonicera japonica var.；Lonicera japonica Thunb.； Neochlorogenic acid； Chlorogenic acid； Cafferic acid；Luteoloside；Luteolin； HPLC；Quantification
紅白忍冬[Lonicera japonica var.chinensis （Wats.） Bak.]为忍冬科忍冬属，半常绿缠绕木质藤木，是忍冬科植物忍冬的一个变种[1]，其枝蔓呈红色、叶淡紫色，花随花期不同，呈红色、白色、黄色等颜色，香味浓，集药用、观赏于一体，已在全国大面积推广种植。红白忍冬能更为快速地响应盐胁迫，通过提高抗氧化酶活性，增强耐盐性，维持正常的生长发育[2]。《中国药典》2015年版及相关文献对红白忍冬或金银花的质量控制主要为采用HPLC测定绿原酸和木犀草苷的含量[3-4]，药理研究表明新绿原酸和异绿原酸同绿原酸均具有抗菌、抗病毒活性[5]。该研究选择红白忍冬为试验材料，以金银花为对照，对2种植物在盐碱地栽培环境下不同器官中新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、木犀草苷和木犀草素这5种生物活性物质的含量进行评价，以期为应用红白忍冬进行盐碱地资源开发和利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试材。红白忍冬和金银花均产自青口农场盐碱地金银花种植园（连云港），经胡玉涛副教授鉴定为Lonicera japonica var.chinensis （Wats.） Bak.和Lonicera japonica Thunb.。经检测采收期种植基地土壤pH为 8.16，含盐量为0.33%。 1.1.2 试剂。新绿原酸（批号20160728）、绿原酸（批号20160625）、咖啡酸（批号20161009）、木犀草苷（批号20160322）和木犀草素（批号20160201）均由南京泽朗生物科技有限公司提供，5种对照品经HPLC峰面积归一化法检测质量分数均在98%以上。甲醇、乙腈为色谱纯（Merk公司）；超纯水经过Milli-Q系统纯化制备；其余试剂均为分析纯，购自国药集团。
1.1.3 仪器。日本岛津LC-2010A HT高效液相色谱仪，配有四元低压梯度泵和LC solution色谱工作站；十万分之一电子分析天平（Mettler Toledo AB135-S 型）。
1.2 方法
1.2.1 色谱分析条件。色谱柱为Inertsil ODS-SP C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为0.1%甲酸水溶液-乙腈。梯度洗脱：0～6 min，10%乙腈；6～15 min，10%～30%乙腈；15～30 min，30%～60%乙腈；30～40 min，60%～100%乙腈。体积流量1.0 mL/min；检测波长327 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。
1.2.2 混合对照品溶液的制备。分别精密称取对照品各10 mg，单独以甲醇溶解并定容，制成质量浓度分别为1.0 mg/mL的对照品储备液；分别精密量取适量储备液混合置容量瓶中，以甲醇稀释至刻度，制得系列混合对照品溶液（新绿原酸、绿原酸：1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、100.0、500.0 μg/mL；咖啡酸：0.2、0.5、1.0、5.0、20.0、50.0、100.0 μg/mL；木犀草苷、木犀草素：0.10、0.25、0.50、1.00、5.00、20.00、50.00 μg/mL），避光保存。
1.2.3 供试品溶液的制备。新采摘的红白忍冬和金银花的花蕾、已开放的花、嫩茎和新叶单独烘干粉碎过筛，精密称定20 g，精密加入85%乙醇220 mL，55 ℃水浴回流40 min，重复2次，2次提取液合并滤过，旋蒸浓缩至100 mL，避光保存，临用前10 000 r/min离心10 min，取上清液作为供试品溶液。
1.2.4 方法学考察。
1.2.4.1 系统适应性和专属性考察。分别精密量取系列质量浓度的混合对照品溶液10 μL，按照“1.2.1”色谱条件操作，注入液相色谱仪进行测定，记录色谱图，考察系统适应性。
1.2.4.2 线性关系考察。分别精密量取系列质量浓度的混合对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积积分值（Y）对质量浓度（X）进行线性回归，得回归方程。取混合对照品储备液不断稀释后进样分析，以10 倍信噪比确定最低定量限。
1.2.4.3 精密度试验。精密吸取最低、中间和最高质量浓度的对照品溶液10 μL，连续进样6次，按“1.2.1”色谱条件测定峰面积值，求得日内精密度RSD；连续分析3 d，每天进样2 次，求得日间精密度RSD。
1.2.4.4 稳定性试验。取同一份供试品溶液（No.01系列），分别于制备后0、4、8、12、24、36 h 注入液相色谱仪，测定组分的量。
1.2.4.5 重复性试验。取同一批样品6 份，按“1.2.3”方法制备供试品溶液，进样分析测定含量。
1.2.4.6 回收率试验。取已定量的红白忍冬和金银花的花蕾、嫩茎和新叶各6 份，每份20 g，精密称定，每份中分别精密加入含绿原酸（1.0 mg/mL）和木犀草素（0.1 mg/mL）的混合对照品溶液10 mL，按“1.2.3”方法制备供试品溶液，进样测定，计算平均回收率。
1.2.5 样品的含量测定。分别精密吸取供试品溶液10 μL，按“1.2.1”色谱条件测定，记录新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、木犀草苷和木犀草素的峰面积，并用外标法计算。
2 结果与分析
2.1 方法学考察
2.1.1 专属性考察。由图1可知，供试品中5种待测成分色谱峰的分离度均大于1.5，其他杂质峰及空白对照溶液对待测成分均无干扰，方法专属性良好。
2.1.2 线性关系考察。按照“1.2.4.2”操作，结果发现（表1），新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、木犀草苷和木犀草素这5种化合物在浓度范围内线性良好，各化合物相关系数r≥0.998；各化合物的最低定量限均低于0.1 μg/mL，表明该方法适合于微量定量分析。
2.1.3 精密度试验。按照“1.2.4.3”操作，结果测得5种化合物的日内和日间精密度RSD均小于4.2%（表1），数值在合格范围内，说明该方法准确度良好。
2.1.4 稳定性试验。按照“1.2.4.4”操作，结果得出新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、木犀草苷和木犀草素的峰面积RSD分别为1.85%、2.15%、0.73%、2.85%、1.66%，表明供试品溶液在36 h 内稳定。
2.1.5 重复性试验。按照“1.2.4.5”操作，结果得出红白忍冬中新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、木犀草苷和木犀草素的平均质量的RSD分别为1.02%、1.77%、2.18%、3.35%、1.42%；金银花中5种化合物的平均质量的RSD小于2.05%。表明该方法重复性良好。
2.1.6 回收率试验。按照“1.2.4.6”操作，计算得出红白忍冬中新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、木犀草苷和木犀草素的平均回收率分别为97.60%、97.35%、95.60%、96.32%和96.67%，RSD分别为0.84%、1.69%、2.02%、1.55%、0.96%；金银花中5种成分的平均回收率为96.68%～97.21%，RSD均小于2.25%。表明该方法具有良好的回收率。
2.2 含量测定 从表2可以看出，相同器官中，各化合物的含量在红白忍冬中均低于金银花。红白忍冬中新绿原酸、绿原酸、咖啡酸这3种化合物在花蕾中含量较高，与金银花中这3种成分在不同器官中分布一致，均表现为花蕾>叶>花>茎；而木犀草苷和木犀草素在叶和茎的含量高于花和花蕾。
3 结论与讨论
以85%乙醇回流提取40 min为主要提取条件，以乙腈-甲酸水构成的洗脱系统各成分的提取与分离效果均较好，各色谱峰的分离度和理论塔板数符合要求。中药材药理作用的发挥通常是多成分协同作用的结果，应用HPLC能同时测定红白忍冬与金银花不同产品器官中新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、木犀草苷和木犀草素这5种化合物的含量，该方法便捷实用科学合理。在一定程度的盐胁迫情况下，红白忍冬和金银花等植物体内的盐离子、脯氨酸等含量以及生理机能将发生变化以增强耐盐性[6-7]。而绿原酸、木犀草苷等有效成分的积累是否会受到影响，还需要进一步的研究。盐碱地栽培红白忍冬与金银花均能获得含有一定有效成分的产品器官，可以作为今后滩涂盐碱地绿化或者开发的植物资源。
参考文献
[1] 中国科学院中國植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京：科学出版社，1998：238-239.
[2] 程淑娟，唐东芹，刘群录.盐胁迫对两种忍冬属植物活性氧平衡的影响[J].南京林业大学学报（自然科学版），2013，37（1）：137-141.
[3] 国家药典委员会.中国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2015.
[4] 李建军，贾国伦，王君，等.红白忍冬不同花期花蕾千蕾质量及指标成分含量比较[J].河南农业大学学报，2013，47（5）：534-537.
[5] 李祖晟.二咖啡酰奎宁酸药理实验研究进展[J].医学综述，2004， 10（4）：249-251.
[6] 王丽萍，石伟，吕廷良，等.盐胁迫下红花金银花体内离子含量变化及其盐碱地栽培技术[J].山东林业科技，2011， 41（3）：49-51.
[7] 鲍雅静，季静，王迪，等.不同品种金银花叶片中脯氨酸对盐胁迫的响应[J].安徽农业科学，2011，39（8）：4502-4503.
关键词 红白忍冬；金银花；新绿原酸；绿原酸；咖啡酸；木犀草苷；木犀草素；高效液相色谱；定量分析
中图分类号 R284 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）34-0126-02
Abstract [Objective] The research aimed to establish HPLC method for simultaneous determination of neochlorogenic acid，chlorogenic acid，cafferic acid，luteoloside and luteolin in L.japonica var.and L.japonica Thunb.cultivated in saline soil，and compare the contents of five components in different plant organs.[Method]The chromatographic column was Inertsil ODSSP C18 column （250 mm × 4.6 mm，5 μm）； the mobile phase was 0.1% formic acid aqueous solutionacetonitrile；volume flow rate was 1.0 mL/min； detection wavelength was 327 nm； column temperature was 30 ℃.[Result]Neochlorogenic acid and chlorogenic acid in 1.0 -500.0 μg/mL，caffeic acid in 0.2 - 100.0 μg/mL，luteoloside and luteolin in 0.1 - 50.0 μg/mL had a good linear relationship；The RSD values of the inter- and intra- precisions were less than 4.2%.The stability was accepted within 36 h.The average recovery rate were 95.60% -97.35%.The contents of five compounds in L.japonica Thunb.were higher than those in L.japonica var.，but the contents of five compounds in L.japonica var.was enough.[Conclusion]The method is simple and convenient，and is suitable for the quantitative determination of biologically active compounds in Lonicera japonica var..It can provide scientific and reliable analytical techniques for the quality control of the medicinal materials.
Key words Lonicera japonica var.；Lonicera japonica Thunb.； Neochlorogenic acid； Chlorogenic acid； Cafferic acid；Luteoloside；Luteolin； HPLC；Quantification
紅白忍冬[Lonicera japonica var.chinensis （Wats.） Bak.]为忍冬科忍冬属，半常绿缠绕木质藤木，是忍冬科植物忍冬的一个变种[1]，其枝蔓呈红色、叶淡紫色，花随花期不同，呈红色、白色、黄色等颜色，香味浓，集药用、观赏于一体，已在全国大面积推广种植。红白忍冬能更为快速地响应盐胁迫，通过提高抗氧化酶活性，增强耐盐性，维持正常的生长发育[2]。《中国药典》2015年版及相关文献对红白忍冬或金银花的质量控制主要为采用HPLC测定绿原酸和木犀草苷的含量[3-4]，药理研究表明新绿原酸和异绿原酸同绿原酸均具有抗菌、抗病毒活性[5]。该研究选择红白忍冬为试验材料，以金银花为对照，对2种植物在盐碱地栽培环境下不同器官中新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、木犀草苷和木犀草素这5种生物活性物质的含量进行评价，以期为应用红白忍冬进行盐碱地资源开发和利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试材。红白忍冬和金银花均产自青口农场盐碱地金银花种植园（连云港），经胡玉涛副教授鉴定为Lonicera japonica var.chinensis （Wats.） Bak.和Lonicera japonica Thunb.。经检测采收期种植基地土壤pH为 8.16，含盐量为0.33%。 1.1.2 试剂。新绿原酸（批号20160728）、绿原酸（批号20160625）、咖啡酸（批号20161009）、木犀草苷（批号20160322）和木犀草素（批号20160201）均由南京泽朗生物科技有限公司提供，5种对照品经HPLC峰面积归一化法检测质量分数均在98%以上。甲醇、乙腈为色谱纯（Merk公司）；超纯水经过Milli-Q系统纯化制备；其余试剂均为分析纯，购自国药集团。
1.1.3 仪器。日本岛津LC-2010A HT高效液相色谱仪，配有四元低压梯度泵和LC solution色谱工作站；十万分之一电子分析天平（Mettler Toledo AB135-S 型）。
1.2 方法
1.2.1 色谱分析条件。色谱柱为Inertsil ODS-SP C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为0.1%甲酸水溶液-乙腈。梯度洗脱：0～6 min，10%乙腈；6～15 min，10%～30%乙腈；15～30 min，30%～60%乙腈；30～40 min，60%～100%乙腈。体积流量1.0 mL/min；检测波长327 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。
1.2.2 混合对照品溶液的制备。分别精密称取对照品各10 mg，单独以甲醇溶解并定容，制成质量浓度分别为1.0 mg/mL的对照品储备液；分别精密量取适量储备液混合置容量瓶中，以甲醇稀释至刻度，制得系列混合对照品溶液（新绿原酸、绿原酸：1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、100.0、500.0 μg/mL；咖啡酸：0.2、0.5、1.0、5.0、20.0、50.0、100.0 μg/mL；木犀草苷、木犀草素：0.10、0.25、0.50、1.00、5.00、20.00、50.00 μg/mL），避光保存。
1.2.3 供试品溶液的制备。新采摘的红白忍冬和金银花的花蕾、已开放的花、嫩茎和新叶单独烘干粉碎过筛，精密称定20 g，精密加入85%乙醇220 mL，55 ℃水浴回流40 min，重复2次，2次提取液合并滤过，旋蒸浓缩至100 mL，避光保存，临用前10 000 r/min离心10 min，取上清液作为供试品溶液。
1.2.4 方法学考察。
1.2.4.1 系统适应性和专属性考察。分别精密量取系列质量浓度的混合对照品溶液10 μL，按照“1.2.1”色谱条件操作，注入液相色谱仪进行测定，记录色谱图，考察系统适应性。
1.2.4.2 线性关系考察。分别精密量取系列质量浓度的混合对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积积分值（Y）对质量浓度（X）进行线性回归，得回归方程。取混合对照品储备液不断稀释后进样分析，以10 倍信噪比确定最低定量限。
1.2.4.3 精密度试验。精密吸取最低、中间和最高质量浓度的对照品溶液10 μL，连续进样6次，按“1.2.1”色谱条件测定峰面积值，求得日内精密度RSD；连续分析3 d，每天进样2 次，求得日间精密度RSD。
1.2.4.4 稳定性试验。取同一份供试品溶液（No.01系列），分别于制备后0、4、8、12、24、36 h 注入液相色谱仪，测定组分的量。
1.2.4.5 重复性试验。取同一批样品6 份，按“1.2.3”方法制备供试品溶液，进样分析测定含量。
1.2.4.6 回收率试验。取已定量的红白忍冬和金银花的花蕾、嫩茎和新叶各6 份，每份20 g，精密称定，每份中分别精密加入含绿原酸（1.0 mg/mL）和木犀草素（0.1 mg/mL）的混合对照品溶液10 mL，按“1.2.3”方法制备供试品溶液，进样测定，计算平均回收率。
1.2.5 样品的含量测定。分别精密吸取供试品溶液10 μL，按“1.2.1”色谱条件测定，记录新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、木犀草苷和木犀草素的峰面积，并用外标法计算。
2 结果与分析
2.1 方法学考察
2.1.1 专属性考察。由图1可知，供试品中5种待测成分色谱峰的分离度均大于1.5，其他杂质峰及空白对照溶液对待测成分均无干扰，方法专属性良好。
2.1.2 线性关系考察。按照“1.2.4.2”操作，结果发现（表1），新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、木犀草苷和木犀草素这5种化合物在浓度范围内线性良好，各化合物相关系数r≥0.998；各化合物的最低定量限均低于0.1 μg/mL，表明该方法适合于微量定量分析。
2.1.3 精密度试验。按照“1.2.4.3”操作，结果测得5种化合物的日内和日间精密度RSD均小于4.2%（表1），数值在合格范围内，说明该方法准确度良好。
2.1.4 稳定性试验。按照“1.2.4.4”操作，结果得出新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、木犀草苷和木犀草素的峰面积RSD分别为1.85%、2.15%、0.73%、2.85%、1.66%，表明供试品溶液在36 h 内稳定。
2.1.5 重复性试验。按照“1.2.4.5”操作，结果得出红白忍冬中新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、木犀草苷和木犀草素的平均质量的RSD分别为1.02%、1.77%、2.18%、3.35%、1.42%；金银花中5种化合物的平均质量的RSD小于2.05%。表明该方法重复性良好。
2.1.6 回收率试验。按照“1.2.4.6”操作，计算得出红白忍冬中新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、木犀草苷和木犀草素的平均回收率分别为97.60%、97.35%、95.60%、96.32%和96.67%，RSD分别为0.84%、1.69%、2.02%、1.55%、0.96%；金银花中5种成分的平均回收率为96.68%～97.21%，RSD均小于2.25%。表明该方法具有良好的回收率。
2.2 含量测定 从表2可以看出，相同器官中，各化合物的含量在红白忍冬中均低于金银花。红白忍冬中新绿原酸、绿原酸、咖啡酸这3种化合物在花蕾中含量较高，与金银花中这3种成分在不同器官中分布一致，均表现为花蕾>叶>花>茎；而木犀草苷和木犀草素在叶和茎的含量高于花和花蕾。
3 结论与讨论
以85%乙醇回流提取40 min为主要提取条件，以乙腈-甲酸水构成的洗脱系统各成分的提取与分离效果均较好，各色谱峰的分离度和理论塔板数符合要求。中药材药理作用的发挥通常是多成分协同作用的结果，应用HPLC能同时测定红白忍冬与金银花不同产品器官中新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、木犀草苷和木犀草素这5种化合物的含量，该方法便捷实用科学合理。在一定程度的盐胁迫情况下，红白忍冬和金银花等植物体内的盐离子、脯氨酸等含量以及生理机能将发生变化以增强耐盐性[6-7]。而绿原酸、木犀草苷等有效成分的积累是否会受到影响，还需要进一步的研究。盐碱地栽培红白忍冬与金银花均能获得含有一定有效成分的产品器官，可以作为今后滩涂盐碱地绿化或者开发的植物资源。
参考文献
[1] 中国科学院中國植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京：科学出版社，1998：238-239.
[2] 程淑娟，唐东芹，刘群录.盐胁迫对两种忍冬属植物活性氧平衡的影响[J].南京林业大学学报（自然科学版），2013，37（1）：137-141.
[3] 国家药典委员会.中国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2015.
[4] 李建军，贾国伦，王君，等.红白忍冬不同花期花蕾千蕾质量及指标成分含量比较[J].河南农业大学学报，2013，47（5）：534-537.
[5] 李祖晟.二咖啡酰奎宁酸药理实验研究进展[J].医学综述，2004， 10（4）：249-251.
[6] 王丽萍，石伟，吕廷良，等.盐胁迫下红花金银花体内离子含量变化及其盐碱地栽培技术[J].山东林业科技，2011， 41（3）：49-51.
[7] 鲍雅静，季静，王迪，等.不同品种金银花叶片中脯氨酸对盐胁迫的响应[J].安徽农业科学，2011，39（8）：4502-4503.