论文部分内容阅读
摘 要：本研究旨在检测F18 产肠毒素大肠杆菌（ETEC）对新生断奶仔猪生长性能和肠道健康的影响以及饲喂直接饲喂型微生物添加剂DFM（百猛灵，明星实验室/美国饲料研究公司）对F18 ETEC引起的断奶仔猪腹泻的影响。试验选择日龄和体重相近、健康状况良好的三元杂交断奶仔猪32头（公母各半，体重6.99 kg±0.33 kg），随机分成4组（2×2因子试验）。试验期25 d：分0～9 d和10 d～25 d两个阶段。第一影响因子：断奶后第13天F18 ETEC攻毒（0或2×109 CFU）；第二影响因子：DFM（第一、二阶段添加量分别为0.15 %和0.10 %）。在第5、9、13、19和25天称量断奶仔猪体重和采食量。第2、3、5、9、12和13天检测粪样得分。第19和24天颈静脉采血收集血液样品。在第25天屠宰将所有仔猪处以安乐死并收集空肠、回肠和脾脏，检测空肠、回肠和结肠内容物的pH。血清和肠道组织用于检测肿瘤坏死因子（TNFα）和丙二醛（MDA）。肠道组织用于组织学评价。结果显示，E. coli口服攻毒后，空肠隐窝深度显著降低（241 ?m～221 ?m），回肠隐窝深度显著增加（255 ?m～284 ?m），粪样分数显著增加（0.45～1.03）。13 d～25 d的仔猪腹泻数明显增加1头～6头。DFM显著可增加断奶仔猪体重（11.8 kg～14.7 kg）、平均日增重（193 g/d～308 g/d）和平均日采食量（193 g/d～308 g/d），但对料重比无影响。DFM显著增加了空肠隐窝深度。绒毛高度和绒毛高度与隐窝深度比值（VCR）的交互作用表明，当猪受E. coli攻毒后，DFM可进一步增加绒毛高度和VCR值。第19天的血清TNFα浓度显示当猪只E. coli攻毒后DFM可进一步减少TNFα。由此可见，E. coli口服攻毒可增加仔猪腹泻发生率，引起肠道形态的轻微改变。DFM可通过增加平均日增重和平均日采食量来改善生长性能。
中图分类号：S816.79 文献标识码：A 文章编号：1001-0769（2016）04-0061-06
1 试验目的
本研究旨在研究日粮中添加DFM（百猛灵，明星实验室/美国饲料研究公司）对断奶仔猪生长性能、肠道健康和由F18 大肠杆菌引起的仔猪腹泻的影响。
2 材料与方法
2.1 动物
试验选用初始重6.99 kg±0.33 kg的32头新断奶三元杂交仔猪（公母各半），以2×2因子设计，随机分到32栏。试验仔猪随机分为4个处理组，每个处理组8个重复。饲喂周期分为两个阶段：0～9 d饲喂第一阶段日粮；10 d～25 d饲喂第二阶段日粮。在第13天，16头仔猪口服灌喂大肠杆菌。分别在0、5 d、9 d、13 d、19 d和25 d检测体重和采食量。攻毒后每天检测粪样变化。
2.2 ETEC攻毒菌株
菌株选择E. coli F18 2144和S1191。从水肿病猪中分离菌株S1191，从腹泻仔猪中分离菌株2144。菌株培养依照Culter等的方法（浓度1×109 CFU）。我们以前的试验已证明这种感染模式可以引起超过50 %的仔猪发生腹泻，并且F18 ETEC可在人和动物体内通过常规病理生理机制诱导临床疾病（Cutler等，2007；McLamb等，2013）。
2.3 试验日粮
本实验中使用的DFM（百猛灵，明星实验室/美国饲料研究公司）是含有1×108 CFU/g嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜热双歧杆菌和屎肠球菌的复合微生态制剂。日粮中DFM添加量根据饲喂阶段的不同分别添加，第一阶段（0.15 %）、第二阶段（0.10 %）。试验日粮根据2×2析因设计。第一影响因子：F18 ETEC攻毒（0或2×109 CFU断奶后13 d）；第二影响因子：DFM（0或1×108 CFU/g）。DFM与对照组日粮混合。整个试验过程中，仔猪自由采食及饮水。营养物质浓度达到NRC标准，计算结果见表1。
2.4 样品收集
在第19天和24天通过采集颈静脉放血，用不含抗凝剂的真空采血管采集血液样品℃。血液通过离心（3 000 g×15 min，4 ℃）后获得血清，并将其保存于-80 ℃，以用于后期MDA和TNFα的检测。在第25天，所有猪通过电击安乐死，取其胃肠道并分割小肠，然后取空肠和回肠中段，用蒸馏水冲洗，一半用于10 %甲醛-磷酸溶液固定，保存用于观察黏膜形态；一半切开用于刮肠道黏膜层，保存至离心管液氮冰冻，后转移至-80 ℃，用于MDA和TNFα浓度的检测。同时收集一管空肠、回肠和结肠的消化物（50 mL），立即使用酸度计检测消化物pH。将消化物直接放于冰上然后存储在-20 ℃。脾脏重量也是反映促炎性细胞因子（例如：TNFα和白介素）表达情况的指标（Touchette等，2002）。
2.5 粪样评分和腹泻率
粪样评分在第2、3、5、9、12和13天检测并在13 d后每日检测。粪样评分采用一致性评价：0 正常；1 轻度；2 中度；3 严重。粪便得分≤1认为没有腹泻（Ronald等，1999）。连续两天保持粪样得分大于1认为是腹泻发生（Liu等，2008）。试验中记录了13 d～19 d、19 d～25 d、13 d～25 d发生腹泻的猪只数。
2.6 小肠形态
两段小肠片段被送至北卡罗莱纳州立大学组织病理学实验室进行检测用苏木精和伊虹染色成多聚赖氨酸载玻片，并用搭载Olympus Van-ox S纤维镜头的SONY CD彩色摄像机进行检测。计算绒毛高度（从绒毛顶端到绒毛隐窝连接处），绒毛宽度（绒毛高度中间处的宽度）和隐窝深度（绒毛隐窝连接处到隐窝根部）。检测每个载玻片上10个完整绒毛长度和相应的隐窝深度。另一工作人员完成所有的小肠形态学分析。 2.7 细胞因子检测
血清和黏膜TNFα的浓度的检测。空肠和回肠黏膜在含蛋白酶抑制剂的PBS溶液中混合均匀，其上清液通过BCA检测（Peace等，2011）蛋白质含量。上清液和血清TNFα用猪TNFα ELISA试剂盒检测来显示炎症和急性反应。简单来说，就是将50 ?L的检测稀释液和 50 ?L的标准液或样品加入到含有包被抗体和生物素抗体反应剂的微板孔中，用辣根过氧化物酶、三甲基苯底物和0.18 M的H2SO4终止液进行检测。用酶标仪检测450 nm和540 nm的吸光值，并用KC4数据分析软件进行分析。TNFα的检测限制为5 pg/mL。
2.8 氧化损伤检测
TBARS试剂盒检测血清和黏膜MDA含量，指示脂质过氧化反应。所有试验流程根据试剂盒厂商说明书进行操作。血清和黏膜中的MDA含量分别用?mol/L和?mol/g表示。
2.9 数据分析
本研究采用2×2析因随机完全区组设计实验方法。出生重和性别为区组，第一影响因子：F18 ETEC；第二影响因子：DFM。一头猪代表一个试验单位，不腹泻猪的数据采用SAS软件的混合程序进行分析处理，腹泻猪数据采用SAS软件的卡方检验进行分析处理。P≤0.05差异显著，P在0.05～0.10之间具有明显趋势。
3 试验结果
3.1 生长性能
从表2可以看出，仔猪初始重无明显差异。整个饲养期，仔猪体重未受E. coli影响。添加DFM，无E. coli组和E. coli组9 d～ 13 d仔猪体重分别增加了13.7 %（P<0.05）和8.4 %（P<0.05）；第13～19天分别增加了20.1 %（P<0.05）和17.6 %（P<0.05）；第19～25天分别增加了28.8 %（P<0.05）和20.1 %（P<0.05）。
整个饲养期，仔猪平均日增重未受E. coli影响。DFM对0～9 d和0～13 d 的平均日增重无影响，但添加DFM组中，无E. coli组和E. coli组9 d～13 d的平均日增重分别增加了104.1 %和131.4 %；13 d～25 d的平均日增重分别增加了58.5 %和44.7 %。整个饲养期，添加DFM组中，无E. coli组和 E. coli组分别增加了71.4 %和47.9 %。
整个饲养期，仔猪平均日采食量未受E. coli影响。DFM对0～13 d平均日采食量无影响，但提高了后期平均日采食量，在添加DFM组中，无E. coli组和E. coli组13 d～19 d的平均日采食量分别增加了54.3 %和41.3 %；19 d～25 d的平均日采食量分别增加了43.4 %和39.7 %；13 d～25 d的平均日采食量分别增加了47.7 %和40.5 %；整个饲养期，添加DFM后平均日采食量分别增加了49.0 %和29.0 %。整个饲养期，E. coli和DFM对料肉比无影响。
3.2 粪样得分和腹泻发生率
从表3可以看出，E. coli攻毒后显著提高了粪便平均评分。无DFM组和DFM组 13 d～19 d的粪便平均评分别显著提高了358.1 %（P<0.05）和159.1 %（P<0.05）； 19 d～25 d的粪便平均评分分别显著增加了40.8 %（P<0.05）和232.1 %（P<0.05）。整个攻毒期，无DFM组和DFM组粪便平均数分别显著增加了166.0 %（P<0.05）和178.9 %（P<0.05）。整个饲养期，无DFM组和DFM组粪便平均评分分别显著增加了174.4 %（P<0.05）和92.2 %（P<0.05）。攻毒前，DFM组显著降低了0～9 d粪便平均评分（分别为0.88和0.86对比0.25和0.63）；但是，DFM组显著提高了 9 d～13 d粪便平均评分（分别为0.38和0.14对比0.83和0.50）。
口服攻毒E. coli显著（P<0.05）增加了13 d～19 d和13 d～25 d仔猪腹泻数，此外，也使19 d～25 d仔猪腹泻只数呈现增加的趋势。
从表4可以看出，13 d～19 d和13 d～ 25 d，E. coli口服攻毒后显著（P<0.05）增加了13 d～19 d和13 d～25 d腹泻仔猪数，19 d～25 d仔猪腹泻只数有增加的趋势。
3.3 组织学评价
从表5可以看出，E. coli显著降低了空肠隐窝深度，无DFM组和DFM组分别降低了8.4 %和8.0 %，且有降低绒毛高度的趋势（P=0.052）；E. coli显著降低了回肠隐窝深度，无DFM组和DFM组分别降低了3.7 %和19.6 %（P<0.05）。DFM显著增加了空肠隐窝深度，无 E. coli组和E. coli组分别增加6.6 %和7.3 %（P<0.05）。E. coli和DFM交互作用显著影响空肠绒毛高度和VCR，当猪用E. coli攻毒后，DFM可进一步增加其水平； E. coli和DFM交互作用存在影响回肠隐窝深度的趋势，当猪用E. coli攻毒后，DFM可进一步增加其水平。
3.4 炎症因子和氧化损伤
从表6可以看出，在攻毒6 d后， E. coli和DFM交互作用可显著影响血清TNFα的水平，当猪用E. coli攻毒后，DFM可进一步降低其水平。
3.5 内容物pH和器官重量
从表7可以看出，E. coli和DFM交互作用有改善空肠内容物pH的趋势，当猪只 E. coli攻毒后，DFM可进一步增加空肠内容物pH水平。
4 结论
基于本研究结果，口服攻毒F18 产肠毒素大肠杆菌会提高仔猪腹泻的发生率，但不会影响其生长性能。添加DFM能够改善猪的平均日增重和平均日采食量，同时能增加空肠的隐窝深度。但是，本试验没有研究添加DFM提高平均日采食量的原因，这有待于进一步的深入研究。
原题名：Efficacy of Dietary Inclusion of Direct-fed Microbial Sin Preventing Post-weaning Diarrhea Caused by F18-positive E. coli in Pigs（英文）
原作者：Sung Woo Kim博士和Yawang Sun硕士研究生助理（北卡罗来纳州立大学动物科学系）
中图分类号：S816.79 文献标识码：A 文章编号：1001-0769（2016）04-0061-06
1 试验目的
本研究旨在研究日粮中添加DFM（百猛灵，明星实验室/美国饲料研究公司）对断奶仔猪生长性能、肠道健康和由F18 大肠杆菌引起的仔猪腹泻的影响。
2 材料与方法
2.1 动物
试验选用初始重6.99 kg±0.33 kg的32头新断奶三元杂交仔猪（公母各半），以2×2因子设计，随机分到32栏。试验仔猪随机分为4个处理组，每个处理组8个重复。饲喂周期分为两个阶段：0～9 d饲喂第一阶段日粮；10 d～25 d饲喂第二阶段日粮。在第13天，16头仔猪口服灌喂大肠杆菌。分别在0、5 d、9 d、13 d、19 d和25 d检测体重和采食量。攻毒后每天检测粪样变化。
2.2 ETEC攻毒菌株
菌株选择E. coli F18 2144和S1191。从水肿病猪中分离菌株S1191，从腹泻仔猪中分离菌株2144。菌株培养依照Culter等的方法（浓度1×109 CFU）。我们以前的试验已证明这种感染模式可以引起超过50 %的仔猪发生腹泻，并且F18 ETEC可在人和动物体内通过常规病理生理机制诱导临床疾病（Cutler等，2007；McLamb等，2013）。
2.3 试验日粮
本实验中使用的DFM（百猛灵，明星实验室/美国饲料研究公司）是含有1×108 CFU/g嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜热双歧杆菌和屎肠球菌的复合微生态制剂。日粮中DFM添加量根据饲喂阶段的不同分别添加，第一阶段（0.15 %）、第二阶段（0.10 %）。试验日粮根据2×2析因设计。第一影响因子：F18 ETEC攻毒（0或2×109 CFU断奶后13 d）；第二影响因子：DFM（0或1×108 CFU/g）。DFM与对照组日粮混合。整个试验过程中，仔猪自由采食及饮水。营养物质浓度达到NRC标准，计算结果见表1。
2.4 样品收集
在第19天和24天通过采集颈静脉放血，用不含抗凝剂的真空采血管采集血液样品℃。血液通过离心（3 000 g×15 min，4 ℃）后获得血清，并将其保存于-80 ℃，以用于后期MDA和TNFα的检测。在第25天，所有猪通过电击安乐死，取其胃肠道并分割小肠，然后取空肠和回肠中段，用蒸馏水冲洗，一半用于10 %甲醛-磷酸溶液固定，保存用于观察黏膜形态；一半切开用于刮肠道黏膜层，保存至离心管液氮冰冻，后转移至-80 ℃，用于MDA和TNFα浓度的检测。同时收集一管空肠、回肠和结肠的消化物（50 mL），立即使用酸度计检测消化物pH。将消化物直接放于冰上然后存储在-20 ℃。脾脏重量也是反映促炎性细胞因子（例如：TNFα和白介素）表达情况的指标（Touchette等，2002）。
2.5 粪样评分和腹泻率
粪样评分在第2、3、5、9、12和13天检测并在13 d后每日检测。粪样评分采用一致性评价：0 正常；1 轻度；2 中度；3 严重。粪便得分≤1认为没有腹泻（Ronald等，1999）。连续两天保持粪样得分大于1认为是腹泻发生（Liu等，2008）。试验中记录了13 d～19 d、19 d～25 d、13 d～25 d发生腹泻的猪只数。
2.6 小肠形态
两段小肠片段被送至北卡罗莱纳州立大学组织病理学实验室进行检测用苏木精和伊虹染色成多聚赖氨酸载玻片，并用搭载Olympus Van-ox S纤维镜头的SONY CD彩色摄像机进行检测。计算绒毛高度（从绒毛顶端到绒毛隐窝连接处），绒毛宽度（绒毛高度中间处的宽度）和隐窝深度（绒毛隐窝连接处到隐窝根部）。检测每个载玻片上10个完整绒毛长度和相应的隐窝深度。另一工作人员完成所有的小肠形态学分析。 2.7 细胞因子检测
血清和黏膜TNFα的浓度的检测。空肠和回肠黏膜在含蛋白酶抑制剂的PBS溶液中混合均匀，其上清液通过BCA检测（Peace等，2011）蛋白质含量。上清液和血清TNFα用猪TNFα ELISA试剂盒检测来显示炎症和急性反应。简单来说，就是将50 ?L的检测稀释液和 50 ?L的标准液或样品加入到含有包被抗体和生物素抗体反应剂的微板孔中，用辣根过氧化物酶、三甲基苯底物和0.18 M的H2SO4终止液进行检测。用酶标仪检测450 nm和540 nm的吸光值，并用KC4数据分析软件进行分析。TNFα的检测限制为5 pg/mL。
2.8 氧化损伤检测
TBARS试剂盒检测血清和黏膜MDA含量，指示脂质过氧化反应。所有试验流程根据试剂盒厂商说明书进行操作。血清和黏膜中的MDA含量分别用?mol/L和?mol/g表示。
2.9 数据分析
本研究采用2×2析因随机完全区组设计实验方法。出生重和性别为区组，第一影响因子：F18 ETEC；第二影响因子：DFM。一头猪代表一个试验单位，不腹泻猪的数据采用SAS软件的混合程序进行分析处理，腹泻猪数据采用SAS软件的卡方检验进行分析处理。P≤0.05差异显著，P在0.05～0.10之间具有明显趋势。
3 试验结果
3.1 生长性能
从表2可以看出，仔猪初始重无明显差异。整个饲养期，仔猪体重未受E. coli影响。添加DFM，无E. coli组和E. coli组9 d～ 13 d仔猪体重分别增加了13.7 %（P<0.05）和8.4 %（P<0.05）；第13～19天分别增加了20.1 %（P<0.05）和17.6 %（P<0.05）；第19～25天分别增加了28.8 %（P<0.05）和20.1 %（P<0.05）。
整个饲养期，仔猪平均日增重未受E. coli影响。DFM对0～9 d和0～13 d 的平均日增重无影响，但添加DFM组中，无E. coli组和E. coli组9 d～13 d的平均日增重分别增加了104.1 %和131.4 %；13 d～25 d的平均日增重分别增加了58.5 %和44.7 %。整个饲养期，添加DFM组中，无E. coli组和 E. coli组分别增加了71.4 %和47.9 %。
整个饲养期，仔猪平均日采食量未受E. coli影响。DFM对0～13 d平均日采食量无影响，但提高了后期平均日采食量，在添加DFM组中，无E. coli组和E. coli组13 d～19 d的平均日采食量分别增加了54.3 %和41.3 %；19 d～25 d的平均日采食量分别增加了43.4 %和39.7 %；13 d～25 d的平均日采食量分别增加了47.7 %和40.5 %；整个饲养期，添加DFM后平均日采食量分别增加了49.0 %和29.0 %。整个饲养期，E. coli和DFM对料肉比无影响。
3.2 粪样得分和腹泻发生率
从表3可以看出，E. coli攻毒后显著提高了粪便平均评分。无DFM组和DFM组 13 d～19 d的粪便平均评分别显著提高了358.1 %（P<0.05）和159.1 %（P<0.05）； 19 d～25 d的粪便平均评分分别显著增加了40.8 %（P<0.05）和232.1 %（P<0.05）。整个攻毒期，无DFM组和DFM组粪便平均数分别显著增加了166.0 %（P<0.05）和178.9 %（P<0.05）。整个饲养期，无DFM组和DFM组粪便平均评分分别显著增加了174.4 %（P<0.05）和92.2 %（P<0.05）。攻毒前，DFM组显著降低了0～9 d粪便平均评分（分别为0.88和0.86对比0.25和0.63）；但是，DFM组显著提高了 9 d～13 d粪便平均评分（分别为0.38和0.14对比0.83和0.50）。
口服攻毒E. coli显著（P<0.05）增加了13 d～19 d和13 d～25 d仔猪腹泻数，此外，也使19 d～25 d仔猪腹泻只数呈现增加的趋势。
从表4可以看出，13 d～19 d和13 d～ 25 d，E. coli口服攻毒后显著（P<0.05）增加了13 d～19 d和13 d～25 d腹泻仔猪数，19 d～25 d仔猪腹泻只数有增加的趋势。
3.3 组织学评价
从表5可以看出，E. coli显著降低了空肠隐窝深度，无DFM组和DFM组分别降低了8.4 %和8.0 %，且有降低绒毛高度的趋势（P=0.052）；E. coli显著降低了回肠隐窝深度，无DFM组和DFM组分别降低了3.7 %和19.6 %（P<0.05）。DFM显著增加了空肠隐窝深度，无 E. coli组和E. coli组分别增加6.6 %和7.3 %（P<0.05）。E. coli和DFM交互作用显著影响空肠绒毛高度和VCR，当猪用E. coli攻毒后，DFM可进一步增加其水平； E. coli和DFM交互作用存在影响回肠隐窝深度的趋势，当猪用E. coli攻毒后，DFM可进一步增加其水平。
3.4 炎症因子和氧化损伤
从表6可以看出，在攻毒6 d后， E. coli和DFM交互作用可显著影响血清TNFα的水平，当猪用E. coli攻毒后，DFM可进一步降低其水平。
3.5 内容物pH和器官重量
从表7可以看出，E. coli和DFM交互作用有改善空肠内容物pH的趋势，当猪只 E. coli攻毒后，DFM可进一步增加空肠内容物pH水平。
4 结论
基于本研究结果，口服攻毒F18 产肠毒素大肠杆菌会提高仔猪腹泻的发生率，但不会影响其生长性能。添加DFM能够改善猪的平均日增重和平均日采食量，同时能增加空肠的隐窝深度。但是，本试验没有研究添加DFM提高平均日采食量的原因，这有待于进一步的深入研究。
原题名：Efficacy of Dietary Inclusion of Direct-fed Microbial Sin Preventing Post-weaning Diarrhea Caused by F18-positive E. coli in Pigs（英文）
原作者：Sung Woo Kim博士和Yawang Sun硕士研究生助理（北卡罗来纳州立大学动物科学系）