论文部分内容阅读
目的 构建含小鼠Hes1基因的重组腺病毒(rAd)并观察其在小鼠海马组织中的表达情况，为进一步研究Hes1基因在成年小鼠神经再生中的作用奠定基础。 方法 利用限制酶对pEGFP-mHes1质粒和pDC316质粒进行酶切，将获得的mHes1目的基因片段和pDC316质粒酶切产物回收，在T4 DNA连接酶作用下连接，形成pDC316-mHes1穿梭质粒，并用PCR法及EcoR Ⅰ+HindⅢ双酶切法对pDC316-mH-Hes1进行鉴定。利用AdMax包装系统，穿梭质粒pDC316-mHes1与骨架质粒pBHGlox_E1，3Cre共转染293细胞，同源重组产生复制缺陷型腺病毒Ad5-mHes1，其报告病毒是包含高强度绿色荧光蛋白(EGFP)的腺病毒Ad5 -EGFP。向成年C57BL/6小鼠海马中立体定向注射Ad5 -mHes1及Ad5-EGFP,Western blotting检测注射后7 d Hes1蛋白在海马中的表达情况，荧光显微镜观察EGFP在海马中的表达情况。 结果 用PCR法及EcoR Ⅰ+HindⅢ双酶切法对pDC316-mHes1鉴定的实验结果与预期结果相符，经测序后其序列与mHes1 CDS序列一致。注射后7d，Hes1蛋白在PBS注射组和Ad5-mHes1注射组海马组织中均有表达，其Hes1蛋白与GAPDH的比值分别为0.363±0.053和0.705±0.128，差异有统计学意义(P＜.05)。荧光显微镜下在海马齿状回颗粒细胞层中观察到Ad5-EGFP表达的绿色荧光。 结论 本研究成功构建了Ad5-mHes1表达载体系统，并在C57BL/6成年小鼠海马组织中表达了Hes1基因。