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摘 要：MicroRNA（miRNA）是生物体内普遍存在的、内源的、非编码的小分子单链RNA， 并被证明在植物抵抗生物和非生物胁迫中起着重要作用。MiRNA1510a是课题组前期从大豆逆境胁迫miRNA表达谱中挑选出的表达量明显上调的一个小RNA。本研究在构建miRNA1510a表达载体基础上，以大豆品种吉育72为材料，利用农杆菌介导的子叶节遗传转化法将miRNA1510a基因转入大豆中。通过PCR检测，最终确定有3株阳性植株，转化率为1.5%。该结果表明miRNA1510a基因已成功转入大豆，为进一步分析miRNA1510a调控大豆抗逆的分子机制奠定了基础。
关键词：大豆；miRNA1510a基因；农杆菌介导法；PCR检测
中图分类号：S565.1 文献标识码：A
1 前 言
1.1 大豆的概述
大豆，是最重要的高蛋白油料经济作物之一，但大面积盐碱、干旱土地的存在严重影响到人类对大豆这种农业经济作物的需求。所以利用基因工程手段改良大豆的耐盐碱、干旱性状，达到利用盐碱、干旱土地的目的已经成为当前研究热点。
1.2 microRNAs的概述
MicroRNA（miRNA）是一类在生物体内普遍存在的、内源的、非编码的小分子单链RNA，长度约为21～24nt。
1.3 植物遗传转化方法
现代生物技术的研究和发展为通过基因工程改良植物品系提供了必要的前提，目前应用于大豆遗传转化的方法主要有基因枪转化法、农杆菌介导转化法、花粉管通道法、病毒介导转化（瞬时转染）、脂质体介导原生质体转化等[1]。其中应用的最广泛的是基因枪法和农杆菌介导法[2]。农杆菌介导的遗传转化方法，是利用根癌农杆菌对植物的侵染特性从而把外援基因导入植物基因组的方法。因为其拷贝数低，整合完整，遗传比较稳定，受目的基因分子量的影响较小以及操作简便，广泛的应用于植物的遗传转化[3-4]。
2 实验材料和方法
2.1 实验材料
2.1.1 植物材料选择
大豆品种为吉育72。
2.1.2 酶与化学试剂
DNA Marker 购自TaKaRa公司，根癌农杆菌EHA105由本实验室自己提供。
2.2 实验方法
2.2.1 农杆菌介导miRNA1510a基因转化大豆
2.2.1.1大豆转化具体过程
无菌受体制备：用吉育72大豆种子用次氯酸钠与盐酸 进行过夜灭菌消毒处理。
种子萌发培养：将灭菌消毒好的大豆无菌外植体放置于装有无菌水的玻璃器皿中浸泡20～30min，放入无菌培养皿中备用。暗培养3～7d。
农杆菌侵染子叶节
a 农杆菌的培养：取出保好的菌液10～15?l，加入50m1 YEP液体培养基中，放置于28℃，180rpm摇床，过夜培养。将菌液加入到50ml离心管中，置于离心机中4500rpm，离心20min，倒掉滤液，保留沉淀，用共培养液体培养基溶解沉淀，用于转化。
b 农杆菌侵染及子叶节转化：用灭菌后的刀和镊子将萌发充分的大豆外植体切开，在下方接近生长点处垂直于外植体边缘轻轻划几下，外植体在远离生长点去弃去1/3备用。将切好的外植体倒入分装好的农杆菌液体中，侵染20～30min。
共培养：取出侵入农杆菌的大豆外植体，放置于装有无菌滤纸的平板上，吸干多余附着的农杆菌。将共培养培养基上放入无菌滤纸，然后用灭菌后的镊子将大豆外植体生长点附近划有刀口的一面朝下，放置于无菌滤纸上，封口，暗培养2～3d。
生芽及芽伸长培养：共培养2～3d后，在超净工作台中，用灭菌后的镊子取出大豆外植体，将生长点附近划有刀口处朝下，45°角倾斜将外植体插入加有10mg/L的BASTA和500mg/L的头孢霉素的生芽培养基中，封口，光照培养待生长点处长出子叶。观察在含有BASTA的生芽培养基中，存活下来的植株，就是具有抗BASTA抗性植株。
生根培养：等到外植体生长点处的真叶完全长成，不定芽长至1cm以上时，可以将生芽培养的外植体转移到生根培养基中，放置于24℃/20℃16h光照的环境中培养15d左右，待长出不定根。
炼苗及移栽：待再生植株根系计较发达时，从培养基中将其拿出，移栽到灭菌后的蛭石和土壤的混合土花盆中，若获得转基因植株，可用于后续的分析实验。
2.2.2转基因大豆初步检测
提取转基因大豆基因组DNA，进行PCR检测，PCR扩增产物用1.0%浓度的琼脂糖凝胶电泳进行检测，初步确定miRNA1510a基因已转入大豆中。
2.2.2.1大豆基因组DNA的提取
利用 TPS法快速提取植物DNA：剪取新鲜大豆叶片2 cm，放入1.5ml的离心管中，加入400?l TPS提取液，用1ml枪头捣碎。将捣碎的叶片放入75℃水浴20min。12000rpm离心10min。将上清转入1支新的1.5ml离心管，加入等体积异丙醇，沉淀一会，5000rpm离心10min。 弃上清，保留沉淀，加入200?l70%乙醇，5000rpm离心5min。弃上清，将沉淀干燥，加灭菌水30～40ul回溶DNA，放于-20℃备用。
2.2.2.2PCR检测
将提取好的miRNA1510a转基因大豆基因组DNA作为模板，以设计好的Bar基因引物F和R为引物进行PCR扩增。设置3个对照组，分别为：Maker对照；N阴性对照；P以质粒为模板的阳性对照。整个反应体系中，其他组成成分相同。
2.2.2.3 琼脂糖凝胶电泳
PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测，步骤如下： 制备1%琼脂糖凝胶（大胶50ml，小胶30ml）： 称取0.3g琼脂糖于100ml锥形瓶中，加入30ml（1×TAE），塞上瓶塞。微波炉加热2min，待琼脂糖全部融化后，取出摇匀，室温冷却至约60℃。
胶板的制备：将电泳胶模置于电泳槽中水平位置，固定好制胶梳子。待琼脂糖凝胶冷却至60℃左右时，滴加入1/10000核酸染料，缓慢倒入电泳胶模中，使琼脂糖凝胶的厚度约在3～5mm。室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔出梳子，将凝胶及内槽一同放入电泳槽中。往电泳槽中添加 1×TAE电泳缓冲液直至没过胶板3mm以上为止。
加样：将7ulDNA样品和3?l的6×Loading Buffer混合均匀。用微量移液器将混合液小心加入至加样孔内，再加入适当大小的DNA marker。
电泳：电泳时DNA从负极向正极移动。电泳结束后戴一次性塑料手套小心取出凝胶，尽可能地将电泳缓冲液淋干，凝胶成像系统拍摄照片保存。
3 结果与分析
3.1 农杆菌介导
miRNA1510a基因转化MicroRNA1510a基因向大豆的转化过程中，经过预培养，侵染，共培养后，转化的大豆生长旺盛。然后将转化后的大豆在含有10mg/L的BASTA和500mg/L的头孢霉素（抑制农杆菌生长）的生芽培养基中上进行选择培养，以及生根培养，移栽等，最后获得24株转基因大豆抗性苗。
3.2 转基因大豆PCR及电泳检测结果
由BASTA筛选得到的阳性植株，并不能充分说明就是转基因植株。因为不同再生个体间的BASTA抗性也有差异，所以需用分子生物学手段来检测。待转基因大豆长到5～6片叶片时，对大豆的抗性植株进行检测。提取转基因大豆基因组DNA，将提取好的miRNA1510a转基因大豆基因组DNA作为模板，以设计好的Bar基因引物F和R为引物进行PCR扩增，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。结果表明，经PCR检测，共有3株转基因大豆在959bp处出现了特异性扩增条带，说明目的基因miRNA1510a已转入吉育72大豆中。
4讨 论
4.1本研究采 用以大豆子叶节为外植体的农杆菌介导遗传转化体系，具有操作简便，外植体的获得不受季节影响，组培周期比较短等特点，与基因枪转化和传统的农杆菌介导的大豆体细胞胚再生系统的方法相比，相对比较容易操作难度较小，成本更低，转化周期大大缩短，分化效率高，获得抗性植株比较容易。本实验通过农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法将miRNA1510a转入大豆，最终经PCR鉴定获得3株T0代转基因阳性植株。
4.2本研究转 化的miRNA1510a基因是生物反应器中心抗逆实验室miRNA课题组前期从大豆逆境胁迫miRNA表达谱中挑选出的表达量明显上调的一个小RNA，并成功构建miRNA1510a表达载体，利用农杆菌介导的遗传转化方法将miRNA1510a基因转入大豆中。但目前获得的只是初步结果，为了获得有应用前景的转基因大豆材料，还需扩大后代群体的规模，从中筛选出稳定遗传、综合性状良好、可用于生产实践的转基因大豆新品种， 期望miRNA1510a基因可真正用来广泛改良大豆的抗逆性。
4.3基因的转 化常常伴随着假阳性的产生，本实验获得24株大豆幼苗，经PCR鉴定只有3株有目的条带，假阳性率较高为87.5%。而假阳性产生的可能原因有：外植体的再生部位与选择培养基未充分接触；在继代过程中目的基因丢失；转化细胞对非转化细胞的滋养作用；在转化过程中目的基因没有完全整合到植物基因组中；培养基中BASTA分布不均匀；实验中的BASTA的筛选浓度为10mg/l，可能比较低。因此后来的PCR 检测非常重要，可以初步排除假阳性植株。
5 结 论
5.1采用大豆 子叶节作为受体的转化系统，具有比较明显的优势，操作容易，不需要太多的繁琐步骤；分化效率及转化率较高；外植体的获得不受季节影响；转化周期相对较短，从组培开始到最终获得转基因苗只需要大约3个月的时间。
5.2本研究以 吉育72大豆为材料，利用农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法将miRNA1510a基因转入大豆中。共计侵染200个大豆子叶节外植体，最后得到24株大豆幼苗。通过对所获得大豆幼苗进行PCR检测，最终获得3株T0代转基因阳性植株，转化率为1.5%，表明miRNA1510a基因已成功转入大豆。
参考文献
[1] Bidney D，Scelonge C.Microprojectile bombardment of plant tissue increase transformation frequency by Agrobacterium tumefaciens[J]. Plant Mol Boi1. 1992， 18：301-313.
[2] Maeshima M.Vacuolar H -pyrophosphatase[J]. Biochim BiophysActa. 2000， 1465（1） ：37-51.
[3] Chan L. Expression and inheritance of multiple transgenes in rice Plants[J]. Nature Biotechnlogy. 1998，16：1060-1064.
[4] Peerbolte R， Leenhouts K，Hooykaas-van Slogteren G M S， Wullems G J， Schilperoort R A.Clones froma shooty tobacco crown gall tumor II：irregular T-DNA structures and organization， T-DNA methylation and conditional expression of opine genes[J]. Plant Mol Bio. 1986， 7：285-299.
关键词：大豆；miRNA1510a基因；农杆菌介导法；PCR检测
中图分类号：S565.1 文献标识码：A
1 前 言
1.1 大豆的概述
大豆，是最重要的高蛋白油料经济作物之一，但大面积盐碱、干旱土地的存在严重影响到人类对大豆这种农业经济作物的需求。所以利用基因工程手段改良大豆的耐盐碱、干旱性状，达到利用盐碱、干旱土地的目的已经成为当前研究热点。
1.2 microRNAs的概述
MicroRNA（miRNA）是一类在生物体内普遍存在的、内源的、非编码的小分子单链RNA，长度约为21～24nt。
1.3 植物遗传转化方法
现代生物技术的研究和发展为通过基因工程改良植物品系提供了必要的前提，目前应用于大豆遗传转化的方法主要有基因枪转化法、农杆菌介导转化法、花粉管通道法、病毒介导转化（瞬时转染）、脂质体介导原生质体转化等[1]。其中应用的最广泛的是基因枪法和农杆菌介导法[2]。农杆菌介导的遗传转化方法，是利用根癌农杆菌对植物的侵染特性从而把外援基因导入植物基因组的方法。因为其拷贝数低，整合完整，遗传比较稳定，受目的基因分子量的影响较小以及操作简便，广泛的应用于植物的遗传转化[3-4]。
2 实验材料和方法
2.1 实验材料
2.1.1 植物材料选择
大豆品种为吉育72。
2.1.2 酶与化学试剂
DNA Marker 购自TaKaRa公司，根癌农杆菌EHA105由本实验室自己提供。
2.2 实验方法
2.2.1 农杆菌介导miRNA1510a基因转化大豆
2.2.1.1大豆转化具体过程
无菌受体制备：用吉育72大豆种子用次氯酸钠与盐酸 进行过夜灭菌消毒处理。
种子萌发培养：将灭菌消毒好的大豆无菌外植体放置于装有无菌水的玻璃器皿中浸泡20～30min，放入无菌培养皿中备用。暗培养3～7d。
农杆菌侵染子叶节
a 农杆菌的培养：取出保好的菌液10～15?l，加入50m1 YEP液体培养基中，放置于28℃，180rpm摇床，过夜培养。将菌液加入到50ml离心管中，置于离心机中4500rpm，离心20min，倒掉滤液，保留沉淀，用共培养液体培养基溶解沉淀，用于转化。
b 农杆菌侵染及子叶节转化：用灭菌后的刀和镊子将萌发充分的大豆外植体切开，在下方接近生长点处垂直于外植体边缘轻轻划几下，外植体在远离生长点去弃去1/3备用。将切好的外植体倒入分装好的农杆菌液体中，侵染20～30min。
共培养：取出侵入农杆菌的大豆外植体，放置于装有无菌滤纸的平板上，吸干多余附着的农杆菌。将共培养培养基上放入无菌滤纸，然后用灭菌后的镊子将大豆外植体生长点附近划有刀口的一面朝下，放置于无菌滤纸上，封口，暗培养2～3d。
生芽及芽伸长培养：共培养2～3d后，在超净工作台中，用灭菌后的镊子取出大豆外植体，将生长点附近划有刀口处朝下，45°角倾斜将外植体插入加有10mg/L的BASTA和500mg/L的头孢霉素的生芽培养基中，封口，光照培养待生长点处长出子叶。观察在含有BASTA的生芽培养基中，存活下来的植株，就是具有抗BASTA抗性植株。
生根培养：等到外植体生长点处的真叶完全长成，不定芽长至1cm以上时，可以将生芽培养的外植体转移到生根培养基中，放置于24℃/20℃16h光照的环境中培养15d左右，待长出不定根。
炼苗及移栽：待再生植株根系计较发达时，从培养基中将其拿出，移栽到灭菌后的蛭石和土壤的混合土花盆中，若获得转基因植株，可用于后续的分析实验。
2.2.2转基因大豆初步检测
提取转基因大豆基因组DNA，进行PCR检测，PCR扩增产物用1.0%浓度的琼脂糖凝胶电泳进行检测，初步确定miRNA1510a基因已转入大豆中。
2.2.2.1大豆基因组DNA的提取
利用 TPS法快速提取植物DNA：剪取新鲜大豆叶片2 cm，放入1.5ml的离心管中，加入400?l TPS提取液，用1ml枪头捣碎。将捣碎的叶片放入75℃水浴20min。12000rpm离心10min。将上清转入1支新的1.5ml离心管，加入等体积异丙醇，沉淀一会，5000rpm离心10min。 弃上清，保留沉淀，加入200?l70%乙醇，5000rpm离心5min。弃上清，将沉淀干燥，加灭菌水30～40ul回溶DNA，放于-20℃备用。
2.2.2.2PCR检测
将提取好的miRNA1510a转基因大豆基因组DNA作为模板，以设计好的Bar基因引物F和R为引物进行PCR扩增。设置3个对照组，分别为：Maker对照；N阴性对照；P以质粒为模板的阳性对照。整个反应体系中，其他组成成分相同。
2.2.2.3 琼脂糖凝胶电泳
PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测，步骤如下： 制备1%琼脂糖凝胶（大胶50ml，小胶30ml）： 称取0.3g琼脂糖于100ml锥形瓶中，加入30ml（1×TAE），塞上瓶塞。微波炉加热2min，待琼脂糖全部融化后，取出摇匀，室温冷却至约60℃。
胶板的制备：将电泳胶模置于电泳槽中水平位置，固定好制胶梳子。待琼脂糖凝胶冷却至60℃左右时，滴加入1/10000核酸染料，缓慢倒入电泳胶模中，使琼脂糖凝胶的厚度约在3～5mm。室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔出梳子，将凝胶及内槽一同放入电泳槽中。往电泳槽中添加 1×TAE电泳缓冲液直至没过胶板3mm以上为止。
加样：将7ulDNA样品和3?l的6×Loading Buffer混合均匀。用微量移液器将混合液小心加入至加样孔内，再加入适当大小的DNA marker。
电泳：电泳时DNA从负极向正极移动。电泳结束后戴一次性塑料手套小心取出凝胶，尽可能地将电泳缓冲液淋干，凝胶成像系统拍摄照片保存。
3 结果与分析
3.1 农杆菌介导
miRNA1510a基因转化MicroRNA1510a基因向大豆的转化过程中，经过预培养，侵染，共培养后，转化的大豆生长旺盛。然后将转化后的大豆在含有10mg/L的BASTA和500mg/L的头孢霉素（抑制农杆菌生长）的生芽培养基中上进行选择培养，以及生根培养，移栽等，最后获得24株转基因大豆抗性苗。
3.2 转基因大豆PCR及电泳检测结果
由BASTA筛选得到的阳性植株，并不能充分说明就是转基因植株。因为不同再生个体间的BASTA抗性也有差异，所以需用分子生物学手段来检测。待转基因大豆长到5～6片叶片时，对大豆的抗性植株进行检测。提取转基因大豆基因组DNA，将提取好的miRNA1510a转基因大豆基因组DNA作为模板，以设计好的Bar基因引物F和R为引物进行PCR扩增，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。结果表明，经PCR检测，共有3株转基因大豆在959bp处出现了特异性扩增条带，说明目的基因miRNA1510a已转入吉育72大豆中。
4讨 论
4.1本研究采 用以大豆子叶节为外植体的农杆菌介导遗传转化体系，具有操作简便，外植体的获得不受季节影响，组培周期比较短等特点，与基因枪转化和传统的农杆菌介导的大豆体细胞胚再生系统的方法相比，相对比较容易操作难度较小，成本更低，转化周期大大缩短，分化效率高，获得抗性植株比较容易。本实验通过农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法将miRNA1510a转入大豆，最终经PCR鉴定获得3株T0代转基因阳性植株。
4.2本研究转 化的miRNA1510a基因是生物反应器中心抗逆实验室miRNA课题组前期从大豆逆境胁迫miRNA表达谱中挑选出的表达量明显上调的一个小RNA，并成功构建miRNA1510a表达载体，利用农杆菌介导的遗传转化方法将miRNA1510a基因转入大豆中。但目前获得的只是初步结果，为了获得有应用前景的转基因大豆材料，还需扩大后代群体的规模，从中筛选出稳定遗传、综合性状良好、可用于生产实践的转基因大豆新品种， 期望miRNA1510a基因可真正用来广泛改良大豆的抗逆性。
4.3基因的转 化常常伴随着假阳性的产生，本实验获得24株大豆幼苗，经PCR鉴定只有3株有目的条带，假阳性率较高为87.5%。而假阳性产生的可能原因有：外植体的再生部位与选择培养基未充分接触；在继代过程中目的基因丢失；转化细胞对非转化细胞的滋养作用；在转化过程中目的基因没有完全整合到植物基因组中；培养基中BASTA分布不均匀；实验中的BASTA的筛选浓度为10mg/l，可能比较低。因此后来的PCR 检测非常重要，可以初步排除假阳性植株。
5 结 论
5.1采用大豆 子叶节作为受体的转化系统，具有比较明显的优势，操作容易，不需要太多的繁琐步骤；分化效率及转化率较高；外植体的获得不受季节影响；转化周期相对较短，从组培开始到最终获得转基因苗只需要大约3个月的时间。
5.2本研究以 吉育72大豆为材料，利用农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法将miRNA1510a基因转入大豆中。共计侵染200个大豆子叶节外植体，最后得到24株大豆幼苗。通过对所获得大豆幼苗进行PCR检测，最终获得3株T0代转基因阳性植株，转化率为1.5%，表明miRNA1510a基因已成功转入大豆。
参考文献
[1] Bidney D，Scelonge C.Microprojectile bombardment of plant tissue increase transformation frequency by Agrobacterium tumefaciens[J]. Plant Mol Boi1. 1992， 18：301-313.
[2] Maeshima M.Vacuolar H -pyrophosphatase[J]. Biochim BiophysActa. 2000， 1465（1） ：37-51.
[3] Chan L. Expression and inheritance of multiple transgenes in rice Plants[J]. Nature Biotechnlogy. 1998，16：1060-1064.
[4] Peerbolte R， Leenhouts K，Hooykaas-van Slogteren G M S， Wullems G J， Schilperoort R A.Clones froma shooty tobacco crown gall tumor II：irregular T-DNA structures and organization， T-DNA methylation and conditional expression of opine genes[J]. Plant Mol Bio. 1986， 7：285-299.