【摘 要】
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目的 探讨心肌Cav1.2钙通道CT3蛋白片段提取与纯化的方法.方法 将CT3的cDNA插入pGEX-6p-3质粒载体后,转化大肠杆菌BL-21感受态细胞,大量培养并利用异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导CT3的GST融合蛋白表达,并采用超声破碎法进行分离纯化,在10mmol/L二硫苏糖醇(DL-dithiothreitol,DTT)存在的情况下,PreScission蛋白酶切除GST标签,凝胶电泳鉴定CT3蛋白,检测蛋白纯度和相对分子质量.结果 SDS-PAGE结果显示,超声破碎法可以纯化得到G
【机 构】
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中国医科大学药学院药物毒理学教研室,沈阳,110122;东北大学机械工程与自动化学院环境机械研究所,沈阳,110004
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目的 探讨心肌Cav1.2钙通道CT3蛋白片段提取与纯化的方法.方法 将CT3的cDNA插入pGEX-6p-3质粒载体后,转化大肠杆菌BL-21感受态细胞,大量培养并利用异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导CT3的GST融合蛋白表达,并采用超声破碎法进行分离纯化,在10mmol/L二硫苏糖醇(DL-dithiothreitol,DTT)存在的情况下,PreScission蛋白酶切除GST标签,凝胶电泳鉴定CT3蛋白,检测蛋白纯度和相对分子质量.结果 SDS-PAGE结果显示,超声破碎法可以纯化得到GST-CT3融合蛋白,且单纯应用PreScissio蛋白酶酶切GST-CT3,得到的CT3蛋白片段浓度较低,而采用PreScission蛋白酶联合应用DTT则可以成功提取纯化出浓度较高的CT3蛋白片段.结论 超声破碎法联合应用DTT与PreScissio蛋白酶能够提取纯化出高浓度和纯度的CT3蛋白片段,为深入研究CT3的生物学功能奠定了基础.
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