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摘 要 目的：通过分子流行病学调查，研究酒泉地区婴幼儿轮状病毒(RV)腹泻的分型特点。方法：采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)，对2001年11月～2002年12月酒泉地区收集的324例婴幼儿腹泻粪便标本中的204份进行轮状病毒病原检测，并对阳性标本进行分型。结果：ELISA法RV阳性率为54.9%，阳性率与性别无关。不同年龄段的感染率以7～18个月年龄段最高，但各年龄段间差异无显著性意义。不同月份的感染率差异具有显著性意义，发病高峰在2001年11、12月份和2002年10、11月份。在ELISA阳性标本中RT-PCR法检出G3者50例，G1者16例、G2者6例，G9者2例，G3与G1混合感染6例，G3与G2混合感染2例，30例未能分型。G分型阳性标本中检出P[8]型24例，P[4]型14例，未发现P[6]、P[9]、P[10]。结论：轮状病毒是酒泉地区婴幼儿非细菌性腹泻的主要病原，其流行的主要血清型为G3型及G1型。本次研究结果从分子水平初步揭示了酒泉地区轮状病毒的流行情况，为轮状病毒疫苗在该地区的应用提供了流行病学资料。
关键词 腹泻 婴幼儿 轮状病毒 分子流行病学 基因型
资料和方法
2001年11月～2002年12月共采集酒泉市人民医院儿科门诊和住院部婴幼儿腹泻粪便标本324例，置-70℃保存备用。采用SPSS 11.0软件随机抽样选取204例标本进行检测。
用ELISA法检测RV抗原，采用IDEIATM Rotavirus试剂盒，购自英国DakoCytomation Ltd，按说明书操作。
用RT-PCR法对RV病毒株进行血清株与基因型的鉴定，Taq DNA聚合酶和AMV逆转录酶购自美国Promega Corporation；RNA酶抑制剂(RNasin)购自宝生物工程(大连)有限公司；TRIZOL购自Molecular Research Center Inc．；dNTPs购自sbs赛百盛公司；DNA Maker DL 2,000购自宝生物工程(大连)有限公司。采用PTC-100TM PCR仪(美国MJ RESEARCH公司)进行PCR反应。用TRIZOL提取RV核酸。先逆转录合成病毒cDNA，后巢式PCR对RV标本进行分型，方法见文献[1]。
每批分别用已测序证实的粪便标本作为阳性和阴性对照。
统计学方法：采用SPSS 11.0进行统计，计量资料用均数±标准差表示，两组比较采用非配对t检验，计数资料采用X2检验。
结 果
RV腹泻的年龄分布：本研究共采集酒泉市人民医院就诊婴幼儿腹泻粪便标本324例，电脑随机抽样选取204例标本(年龄11.28±7.76个月)进行检测，ELISA法检测RV阳性112例，阳性率为54.9％。其中住院部患儿34例，门诊78例；男68例(年龄11.46±7.54个月)，女41例(年龄11.49±6.52个月)，经非配对t检验显示两组间年龄差异无显著性意义(P>0.05)，经X2检验显示RV阳性率也与性别无关(P>0.05)。在所检出的112份RV阳性标本中，RV腹泻年龄范围2～24个月，平均11.16±7.21个月；在不同年龄段中以7～18个月年龄段RV阳性率最高，为62.07%～72.73%，但经Pearson Chi-square检验显示不同年龄段间的阳性率差异无显著性意义 (P>0.05)。
RV腹泻的流行季节：从连续13个月收集的204例腹泻患儿每月轮状病毒阳性检出率可见，酒泉地区婴幼儿轮状病毒腹泻全年均有发病，经X2检验显示不同月份的阳性检出率差异具有显著性意义 (P<0.01)，发病高峰在2001年11、12月份（分别为79.17%和83.33%）和2002年10、11月份（分别为72.22%和77.78%）。在RV阳性标本中，以上月份所占比率亦最高。
VP7型别：112例轮状病毒抗原阳性标本中再进行RT-PCR法检测VP7 G1-G4、G9 5个血清型，能用后巢式PCR确定型别的共82例（73.21%）。其中G3型50例（44.64%），G1型16例（14.29%），G2型6例（5.36%）， G9型2例（1.78%），未发现G4型。混合感染者8例（7.14%），分别为：G1+G3 6例，G2+G3 2例。另外有30例(26.79%)未能用现有引物分型。
VP4型别：对VP7分型阳性标本随机抽样选取53份进行VP4分型，检测P[4]、P[6]、P[8]、P[9]、P[10] 5个基因型，能确定VP4基因型别的共38例，占71.7%，其中检出P[8]型24例（45.28%），P[4]型14例（26.42%），未发现P[6]、P[9]、P[10]，另外有15例(28.3%)标本未能用现有引物分出VP4型。
酒泉地区轮状病毒株VP7和VP4基因型别的组合：在53例VP7阳性标本中，在同一例标本中同时鉴定出VP7和VP4基因型别的共38例，其中17例为G3 P[8]（44.74%），G1 P[4]6例（15.79%），G3 P[4]5例（13.16%），G1 P[8]5例（13.16%），G2 P[4]2例（5.26%），G2 P[8]1例（2.63%），G1+3 P[4]1例（2.63%），G1+3 P[8]1例（2.63%）。
讨 论
酒泉地区婴幼儿腹泻轮状病毒的感染规律：本研究结果提示，54.9%的非细菌性腹泻是由轮状病毒引起的，而在轮状病毒的流行季节阳性率则高达80%左右，可见预防轮状病毒感染的重要性。本研究收集到的轮状病毒感染粪样均为2岁以下的婴幼儿，不同年龄段的感染率以7～18个月年龄段最高，为62.07%～72.73%，可能与此时由母亲带来的抗体下降、自身的免疫力尚未完全建立有关。以往认为在季节性明显的地区，轮状病毒感染的高发季节是秋冬季，本研究连续13个月的观察显示，在酒泉地区全年均可发病，但高发季节是10～12月，提示我国河西走廊与国内外报道的季节分布有所不同，轮状病毒感染的高发季节以深秋初冬为主。根据以上研究结果，我们建议轮状病毒疫苗的接种对象应为6～18个月的婴幼儿，接种时间应为每年的8～9月份。
酒泉地区轮状病毒VP7、VP4型别及其组成：本研究结果显示，以G3型为主的流行趋势与国内外其他地区以G1型为主明显不同[1,2]，说明RV感染存在明显的地域差别。酒泉地区在此研究期间型别主要集中在G3型，其次为G1型。由于轮状病毒型别繁多，相互之间的交叉保护作用差，因此在研制疫苗时必须考虑到涵盖相应的型别。
不同方法检测轮状病毒的比较：在进行VP7和VP4基因分型时，有相当一部分ELISA阳性标本，在做RT-PCR扩增时结果为阴性。在扩增VP7或VP4时都有这种现象，考虑部分是因为在处理过程中RNA丢失，或非特异性抑制物处理不完全，或部分标本中病毒dsRNA降解和含量太少，因此RT-PCR不能对部分RV dsRNA进行扩增。如果单纯是为了作出轮状病毒感染的诊断，用ELISA法检测RV病毒抗原即可。ELISA法具有方便、价廉的优点，但由于粪样中成分繁杂，存在其他抗原成分，干扰轮状病毒抗原抗体的结合，所以结果有一定的误差，可能出现假阳性或假阴性。本研究中ELISA法检测的阳性率最高，但和RT-PCR法检测结果不符的例数也较多，证实了这点。RT-PCR具有很高的灵敏性和特异性，Gentsch[3]报道可检测10～1000个病毒颗粒，但技术要求高，设备昂贵，基层医院难以普及。将ELISA和RT-PCR结合起来，可以对所检测的轮状病毒有一个较全面的判定。
分子流行病学特点的意义：近20年在我国长春、大同、郑州、广州、上海、北京等城市不同时期的调查结果显示[2,4]，我国流行的轮状病毒血清型虽有所变化，但一直以G1型为主，占67.1%～83.4%。我省兰州地区从2001～2004年间流行的轮状病毒血清型则以G3型为主（61.44%），其次为G2型。国外文献报道近年来轮状病毒呈现新的分子流行病学特点，G3型轮状病毒感染呈上升趋势，部分地区G3占主导地位。本研究结果及以上资料表明，轮状病毒感染在我国的流行也不是单一模式，这些资料为临床诊治和针对性地研究HRV疫苗提供了重要的参考资料。
参考文献
1 方肇寅，晋圣瑾，秦树民，等．PCR方法用于我国A组轮状病毒的分型研究．病毒学报，1994，10：316-321
2 袁丽娟，钱渊，刘军，等.北京等我国四个地区婴幼儿腹泻轮状病毒VP4及VP7型别的研究．病毒学报，1994，10：137-144
3 Gentsch JR，et al.Identification of group A rotavirus gene 4 types by polymerase china reaction.J Clin Microbiol，1992，30：1365-1373
4 曾玫，朱启，张又，等．上海地区婴幼儿腹泻的轮状病毒分子流行病学研究.中华儿科杂志，2004，42(1)：10-15
关键词 腹泻 婴幼儿 轮状病毒 分子流行病学 基因型
资料和方法
2001年11月～2002年12月共采集酒泉市人民医院儿科门诊和住院部婴幼儿腹泻粪便标本324例，置-70℃保存备用。采用SPSS 11.0软件随机抽样选取204例标本进行检测。
用ELISA法检测RV抗原，采用IDEIATM Rotavirus试剂盒，购自英国DakoCytomation Ltd，按说明书操作。
用RT-PCR法对RV病毒株进行血清株与基因型的鉴定，Taq DNA聚合酶和AMV逆转录酶购自美国Promega Corporation；RNA酶抑制剂(RNasin)购自宝生物工程(大连)有限公司；TRIZOL购自Molecular Research Center Inc．；dNTPs购自sbs赛百盛公司；DNA Maker DL 2,000购自宝生物工程(大连)有限公司。采用PTC-100TM PCR仪(美国MJ RESEARCH公司)进行PCR反应。用TRIZOL提取RV核酸。先逆转录合成病毒cDNA，后巢式PCR对RV标本进行分型，方法见文献[1]。
每批分别用已测序证实的粪便标本作为阳性和阴性对照。
统计学方法：采用SPSS 11.0进行统计，计量资料用均数±标准差表示，两组比较采用非配对t检验，计数资料采用X2检验。
结 果
RV腹泻的年龄分布：本研究共采集酒泉市人民医院就诊婴幼儿腹泻粪便标本324例，电脑随机抽样选取204例标本(年龄11.28±7.76个月)进行检测，ELISA法检测RV阳性112例，阳性率为54.9％。其中住院部患儿34例，门诊78例；男68例(年龄11.46±7.54个月)，女41例(年龄11.49±6.52个月)，经非配对t检验显示两组间年龄差异无显著性意义(P>0.05)，经X2检验显示RV阳性率也与性别无关(P>0.05)。在所检出的112份RV阳性标本中，RV腹泻年龄范围2～24个月，平均11.16±7.21个月；在不同年龄段中以7～18个月年龄段RV阳性率最高，为62.07%～72.73%，但经Pearson Chi-square检验显示不同年龄段间的阳性率差异无显著性意义 (P>0.05)。
RV腹泻的流行季节：从连续13个月收集的204例腹泻患儿每月轮状病毒阳性检出率可见，酒泉地区婴幼儿轮状病毒腹泻全年均有发病，经X2检验显示不同月份的阳性检出率差异具有显著性意义 (P<0.01)，发病高峰在2001年11、12月份（分别为79.17%和83.33%）和2002年10、11月份（分别为72.22%和77.78%）。在RV阳性标本中，以上月份所占比率亦最高。
VP7型别：112例轮状病毒抗原阳性标本中再进行RT-PCR法检测VP7 G1-G4、G9 5个血清型，能用后巢式PCR确定型别的共82例（73.21%）。其中G3型50例（44.64%），G1型16例（14.29%），G2型6例（5.36%）， G9型2例（1.78%），未发现G4型。混合感染者8例（7.14%），分别为：G1+G3 6例，G2+G3 2例。另外有30例(26.79%)未能用现有引物分型。
VP4型别：对VP7分型阳性标本随机抽样选取53份进行VP4分型，检测P[4]、P[6]、P[8]、P[9]、P[10] 5个基因型，能确定VP4基因型别的共38例，占71.7%，其中检出P[8]型24例（45.28%），P[4]型14例（26.42%），未发现P[6]、P[9]、P[10]，另外有15例(28.3%)标本未能用现有引物分出VP4型。
酒泉地区轮状病毒株VP7和VP4基因型别的组合：在53例VP7阳性标本中，在同一例标本中同时鉴定出VP7和VP4基因型别的共38例，其中17例为G3 P[8]（44.74%），G1 P[4]6例（15.79%），G3 P[4]5例（13.16%），G1 P[8]5例（13.16%），G2 P[4]2例（5.26%），G2 P[8]1例（2.63%），G1+3 P[4]1例（2.63%），G1+3 P[8]1例（2.63%）。
讨 论
酒泉地区婴幼儿腹泻轮状病毒的感染规律：本研究结果提示，54.9%的非细菌性腹泻是由轮状病毒引起的，而在轮状病毒的流行季节阳性率则高达80%左右，可见预防轮状病毒感染的重要性。本研究收集到的轮状病毒感染粪样均为2岁以下的婴幼儿，不同年龄段的感染率以7～18个月年龄段最高，为62.07%～72.73%，可能与此时由母亲带来的抗体下降、自身的免疫力尚未完全建立有关。以往认为在季节性明显的地区，轮状病毒感染的高发季节是秋冬季，本研究连续13个月的观察显示，在酒泉地区全年均可发病，但高发季节是10～12月，提示我国河西走廊与国内外报道的季节分布有所不同，轮状病毒感染的高发季节以深秋初冬为主。根据以上研究结果，我们建议轮状病毒疫苗的接种对象应为6～18个月的婴幼儿，接种时间应为每年的8～9月份。
酒泉地区轮状病毒VP7、VP4型别及其组成：本研究结果显示，以G3型为主的流行趋势与国内外其他地区以G1型为主明显不同[1,2]，说明RV感染存在明显的地域差别。酒泉地区在此研究期间型别主要集中在G3型，其次为G1型。由于轮状病毒型别繁多，相互之间的交叉保护作用差，因此在研制疫苗时必须考虑到涵盖相应的型别。
不同方法检测轮状病毒的比较：在进行VP7和VP4基因分型时，有相当一部分ELISA阳性标本，在做RT-PCR扩增时结果为阴性。在扩增VP7或VP4时都有这种现象，考虑部分是因为在处理过程中RNA丢失，或非特异性抑制物处理不完全，或部分标本中病毒dsRNA降解和含量太少，因此RT-PCR不能对部分RV dsRNA进行扩增。如果单纯是为了作出轮状病毒感染的诊断，用ELISA法检测RV病毒抗原即可。ELISA法具有方便、价廉的优点，但由于粪样中成分繁杂，存在其他抗原成分，干扰轮状病毒抗原抗体的结合，所以结果有一定的误差，可能出现假阳性或假阴性。本研究中ELISA法检测的阳性率最高，但和RT-PCR法检测结果不符的例数也较多，证实了这点。RT-PCR具有很高的灵敏性和特异性，Gentsch[3]报道可检测10～1000个病毒颗粒，但技术要求高，设备昂贵，基层医院难以普及。将ELISA和RT-PCR结合起来，可以对所检测的轮状病毒有一个较全面的判定。
分子流行病学特点的意义：近20年在我国长春、大同、郑州、广州、上海、北京等城市不同时期的调查结果显示[2,4]，我国流行的轮状病毒血清型虽有所变化，但一直以G1型为主，占67.1%～83.4%。我省兰州地区从2001～2004年间流行的轮状病毒血清型则以G3型为主（61.44%），其次为G2型。国外文献报道近年来轮状病毒呈现新的分子流行病学特点，G3型轮状病毒感染呈上升趋势，部分地区G3占主导地位。本研究结果及以上资料表明，轮状病毒感染在我国的流行也不是单一模式，这些资料为临床诊治和针对性地研究HRV疫苗提供了重要的参考资料。
参考文献
1 方肇寅，晋圣瑾，秦树民，等．PCR方法用于我国A组轮状病毒的分型研究．病毒学报，1994，10：316-321
2 袁丽娟，钱渊，刘军，等.北京等我国四个地区婴幼儿腹泻轮状病毒VP4及VP7型别的研究．病毒学报，1994，10：137-144
3 Gentsch JR，et al.Identification of group A rotavirus gene 4 types by polymerase china reaction.J Clin Microbiol，1992，30：1365-1373
4 曾玫，朱启，张又，等．上海地区婴幼儿腹泻的轮状病毒分子流行病学研究.中华儿科杂志，2004，42(1)：10-15