【摘 要】
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目的 观察微小RNA(miRNA,miR)-202是否通过转录后下调癌基因低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)的表达而抑制人肝癌细胞(HCC)的增殖.方法 培养HCC细胞株QGY-7703、HepG2;采用实
【机 构】
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430071,武汉大学中南医院武汉大学肝胆疾病研究院武汉大学移植中心湖北省移植医学重点实验室;430071 武汉大学中南医院武汉大学肝胆疾病研究院武汉大学移植中心湖北省移植医学重点实验室;中南大学湘雅
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目的 观察微小RNA(miRNA,miR)-202是否通过转录后下调癌基因低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)的表达而抑制人肝癌细胞(HCC)的增殖.方法 培养HCC细胞株QGY-7703、HepG2;采用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测细胞周期蛋白(Cyclin) D1、MYC和LEF1 mRNA的表达;West blot检测LRP6、Cyclin D1、MYC、β-连环蛋白(β-catenin)和磷酸化Rb蛋白的表达;通过转染小干扰RNA (siRNA)抑制肝细胞癌(HCC)细胞LRP6的表达;构建pGL3-LRP6-3端非编码区域(3-UTR)-荧光素酶质粒转染HCC细胞作荧光素酶检测;采用噻唑蓝(MTT)法、克隆形成实验及贴壁不依赖性生长能力测定法检测HCC细胞的增殖能力.结果 在QGY-7703、HepG2两种细胞株均显示,过表达miR-202可以下调LRP6的表达,而抑制miR-202可以上调LRP6的表达(P＜0.05);miR-202的过表达可以降低pGL3-LRP6-3-UTR-荧光素酶报告基因中荧光素酶的活性,而抑制miR-202则可以增加其荧光素酶的活性(P＜0.05);miR-202可以显著下调受Wnt/β-catenin调控的下游基因Cyclin D1、MYC和LEF1的表达,抑制miR-202则可以显著上调这些基因的表达(P＜0.05);在miR-202过表达的HCC细胞,Cyclin D1、MYC、LEF1和磷酸化Rb蛋白的表达也显著下调,而抑制miR-202的表达,则可以上调这些蛋白的表达(P＜0.05);miR-202的表达与LRP6蛋白的表达水平呈显著负相关(r =0.575,P＜0.05);通过MTT法和克隆形成实验结果表明,沉默miR-202抑制组或阴性对照转染组细胞的LRP6,可以降低HCC细胞的生长速度和增殖(P＜0.05);贴壁不依赖性生长能力测定也显示,LRP6抑制对miR-202抑制组HCC细胞的增殖具有显著抑制作用(P＜0.05).结论 在HCC细胞,LRP6mRNA是miR-202的直接作用靶点;在miR-202发挥抑制HCC细胞增殖的作用中,LRP6抑制是必不可少的;LRP6可以作为HCC的潜在治疗靶点.
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