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[摘要]目的探讨应用重组腺病毒载体携带脑源性神经生长因子（BDNF）基因转染雪旺细胞（SCs）的可行性及促进外周神经损伤恢复的有效途径。方法采取6～7天SD乳鼠坐骨神经，利用酶消化法、差速贴壁法分离获得雪旺细胞，阿糖胞苷与Geneticin联合应用纯化、BPE促进雪旺细胞增殖，获取大量高纯度的雪旺细胞。使用含BDNF基因的重组腺病毒（Ad-BDNF），经不同感染复数（MOI）病毒量感染体外培养的大鼠源性SCs。逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测感染后72 h的BDNF mRNA，ELISA定量分析感染后 3 d、6 d、9 d、12 d、15d、18 d和 21 d时感染后SCs培养液上清中BDNF的表达。
关键词：雪旺细胞基因转染脑源性神经生长因子
中图分类号：R329.28 文献标志码：B 文章编号：1004-7484（2010）12-0029-03
脑源性神经生长因子（BDNF）是一种重要的神经营养因子，能够促进创伤后神经的修复与再生和减少神经元的死亡[2]。本研究通过将携带有BDNF基因的重组腺病毒表达载体转染体外培养的雪旺细胞，以检测BDNF基因的调控表达情况。探索基因治疗外周神经损伤的新途径，为进一步临床应用治疗基因通过腺病毒载体转染雪旺细胞促进周围神经损伤修复奠定实验基础。
1材料与方法
1.1材料
倒置相差显微镜；光学显微镜；CO2孵箱；超净工作台；高速冷冻离心机；DUR530核酸蛋白分析仪；PCR仪；微型垂直平板电泳槽及电转移系统；凝胶成像分析系统；酶标仪；DMEM培养液；山羊抗 S-100 多克隆抗体；兔抗 BDNF 多克隆抗体；HRP标记的兔抗山羊IgG抗体；HRP标记的山羊抗兔IgG抗体；DAB显色剂；总RNA提取试剂盒；RT-PCR反应试剂盒；DNA Marker DL2000；硝酸纤维素膜；胎牛血清；胰蛋白酶；Ⅰ型胶原酶；阿糖胞苷；多聚赖氨酸；Geneticin；牛脑垂体提取物；SABC试剂盒；兔抗S-100单抗； ECL 试剂；鼠BDNF蛋白ELISA试剂盒。
1.2方法
1.2.1SCs分离培养取出生6～7天的SD小鼠，由第四军医大学实验动物中心提供，常规引颈处死、消毒，取其两侧坐骨神经，采用0.25%胰蛋白酶与0.15%的Ⅰ型胶原酶混合消化，消化完全后含血清培养液中和、离心，行双30min差速贴壁法两次后接种于预铺有多聚赖氨酸的培养瓶内，37℃、5%CO2孵箱中进行培养。阿糖胞苷与Geneticin进行纯化[3，4]，牛脑垂体提取物（BPE，100µg/ml）促进SCs增殖。待细胞80%融合时准备病毒转染。
1.2.2Ad-BDNF转染雪旺细胞含BDNF基因的重组腺病毒（Ad-BDNF）购自中国军事医学科学院基础医学研究所。在进行转染前，按照M.O.I分别为0（即未经感染的正常SCs）、50、100、200和400 pfu/cell计算所需的病毒量，用无血清DMEM培养液稀释Ad-BDNF原液后取相应体积。将病毒加入孔中，轻柔摇晃培养板使病毒平坦的扩散到单层生长细胞上。37℃、5%CO2孵箱中培养72小时。将各组SCs用 2.5 g/L 胰酶消化制备成细胞悬液，1000 r/min 离心10 min，PBS 洗涤 1 次，收集细胞沉淀备用。
1.2.3总RNA提取及纯度分析按试剂盒说明采用 Trizol液一步法裂解细胞，提取总 RNA。取RNA样品5 μL用995 μL DEPC水稀释（1：200）后，用紫外分光光度计测定 260 nm和 280 nm处的吸光度。每个样品读取三次，取均值。RNA样品浓度=200×A260×40mg/L。以A260/A280比值确定RNA纯度，比值应在 1.8~2.0 范围内。连续进行三次实验，以消除非特异性差异。
1.2.4cDNA引物设计BDNF cDNA特异性引物序列参照文献设计[5]，由上海生工生物技术公司合成。
上游引物为5’-CACTCTGACCCTGCCCGCCGAG，
下游引 物为5’-GCATTTAGGTGACACTATAG-3’，扩增片段长度为 430 bp。
1.2.5 RT-PCR 反应试验按Invitrogen公司的RT-PCR反应试剂盒说明书进行。反应条件：94℃变性 1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1min，30个循环。
1.3统计学分析
应用SPSS 13.0统计软件，两组间同一时间点采用配对t检验，同组内各时间点采用SNK-q检验。
2结果
2.1光镜观察
原代培养雪旺细胞成功后，经阿糖胞苷、Geneticin联合作用，BPE促增殖，传代，镜下见第二代雪旺细胞呈典型的长梭形、双极状，“肩并肩”排列生长。感染后4小时，镜下未见有任何细胞形态变化，状态良好；24小时，镜下见雪旺细胞仍呈双极状、“肩并肩”排列生长；48小时，镜下观察雪旺细胞亦无明显的形态学变化，长势良好。
2.2感染后SCs中BDNF mRNA的表达
提取感染各组和对照组SCs的总RNA，经RT-PCR后均扩增出了约430 bp大小的基因片段，与构建的表达单元大小一致。经灰度分析可知，其中DNA 条带灰度以MOI为200组为著，正常SCs对照组最低（图1）。此结果证实，经 Ad-BDNF 感染后的SCs有外源性 BDNF mRNA 的表达，且表达量明显高于正常SCs；MOI 为 200 感染时，外源性 BDNF 基因转移效率最高。
M0123 4
图1：不同MOI感染SC后BDNF mRNA的表达
（0：正常SC对照组；1：MOI＝50； 2：MOI＝100；3：MOI＝200；4：MOI＝400；M：DNA Marker）
2.3ELISA检测培养液上清中BDNF的表达
从感染后3 d开始，感染后SCs培养液上清中BDNF表达量即开始出现升高，6~12 d升高趋势明显，15~21 d 升高趋势减缓，但BDNF表达量能够维持在较高水平。对照组在各时间点BDNF 表达量均明显低于感染组（P<0.01）（表1）。
表1在不同时间点感染后SC和正常SC培养液上清中BDNF的表达（±s，n=10，μg/L，MOI=200）
时间点（d） 正常SC对照组 感染后 SC 组 P值
3 0.31±0.07 0.63±0.11 <0.01
6 0.41±0.12 0.90±0.13 <0.01
9 0.47±0.13 1.52±0.14 <0.01
12 0.53±0.11 3.18±0.15 <0.01
15 0.56±0.12 3.39±0.15 <0.01
18 0.61±0.12 3.45±0.19 <0.01
21 0.65±0.11 3.57±0.16 <0.01
3讨 论
目前用于感染细胞的病毒载体主要有腺病毒载体系统和逆转录病毒载体系统。其中后者只能感染正在分裂的细胞，并且有插入突变及激活癌基因的危险，繁殖滴度低，故不太适合于体内基因治疗。而腺病毒载体系统具有稳定、安全、滴度高和宿主范围广等优点，还能感染非分裂期细胞，可直接体内应用，适于临床神经系统的基因治疗[6]。在基因转移效率和蛋白表达效率的平衡点上我们选择了腺病毒载体，它不仅能够感染包括神经元细胞和胶质细胞在内的多种细胞，而且感染效率高，容易将外源性基因片段转移到易感细胞中[7]。曹延林等[8]用逆转录病毒BDNF基因成功感染脊髓神经干细胞。因此，我们尝试利用重组腺病毒BDNF基因感染体外培养的SC，以期能进一步应用于周围神经的损伤修复。
我们采用解剖显微镜下机械性剥除神经外膜与束膜、差速贴壁法、阿糖胞苷与Geneticin联合应用纯化、BPE促进雪旺细胞增殖，可以获得纯度90%以上大量雪旺细胞[9]。
Ad-BDNF感染的SCs，RT-PCR检测到BDNF mRNA 的表达，且表达量明显高于正常SCs；ELISA法检测Ad-BDNF感染后SC培养液上清中高度表达BDNF，而正常SCs对照组未检测到BDNF，说明外源性BDNF基因确实转移到SCs体内，并经转录、翻译，最终得以表达。与文献报道的结果相符[10]。Ad-BDNF在MOI为200时转移BDNF基因效率最高，这可能与制备的Ad-BDNF本身性质以及 SD大鼠源性SCs的易感性有关。
总之，通过重组腺病毒介导外源性 BDNF 基因的转移，可以获得能够长时间高度表达BDNF的SC，这将为进一步修复周围神经损伤和保护受损神经元提供保证。此为应用重组腺病毒载体携带脑源性神经生长因子基因转染雪旺细胞促进损伤神经修复奠定了试验基础，探索了基因治疗外周神经损伤的新途径。
参考文献
[1] 韩岩，汤朝伍，王剑波，等.利用Geneticin纯化雪旺细胞的实验研究[J].中华显微外科杂志，1997，20（4）：277-280.
[2] 张勇杰，金岩，聂鑫，等.多步法分离和纯化雪旺细胞的实验研究[J].中华神经外科疾病研究杂志，2002，l（4）：347-350.
[3] 曹延林，罗卓荆，叶正旭.基因重组BDNF感染脊髓神经干细胞及其表达[J].中国矫形外科杂志，2005，l3（17）：1326-1328.
关键词：雪旺细胞基因转染脑源性神经生长因子
中图分类号：R329.28 文献标志码：B 文章编号：1004-7484（2010）12-0029-03
脑源性神经生长因子（BDNF）是一种重要的神经营养因子，能够促进创伤后神经的修复与再生和减少神经元的死亡[2]。本研究通过将携带有BDNF基因的重组腺病毒表达载体转染体外培养的雪旺细胞，以检测BDNF基因的调控表达情况。探索基因治疗外周神经损伤的新途径，为进一步临床应用治疗基因通过腺病毒载体转染雪旺细胞促进周围神经损伤修复奠定实验基础。
1材料与方法
1.1材料
倒置相差显微镜；光学显微镜；CO2孵箱；超净工作台；高速冷冻离心机；DUR530核酸蛋白分析仪；PCR仪；微型垂直平板电泳槽及电转移系统；凝胶成像分析系统；酶标仪；DMEM培养液；山羊抗 S-100 多克隆抗体；兔抗 BDNF 多克隆抗体；HRP标记的兔抗山羊IgG抗体；HRP标记的山羊抗兔IgG抗体；DAB显色剂；总RNA提取试剂盒；RT-PCR反应试剂盒；DNA Marker DL2000；硝酸纤维素膜；胎牛血清；胰蛋白酶；Ⅰ型胶原酶；阿糖胞苷；多聚赖氨酸；Geneticin；牛脑垂体提取物；SABC试剂盒；兔抗S-100单抗； ECL 试剂；鼠BDNF蛋白ELISA试剂盒。
1.2方法
1.2.1SCs分离培养取出生6～7天的SD小鼠，由第四军医大学实验动物中心提供，常规引颈处死、消毒，取其两侧坐骨神经，采用0.25%胰蛋白酶与0.15%的Ⅰ型胶原酶混合消化，消化完全后含血清培养液中和、离心，行双30min差速贴壁法两次后接种于预铺有多聚赖氨酸的培养瓶内，37℃、5%CO2孵箱中进行培养。阿糖胞苷与Geneticin进行纯化[3，4]，牛脑垂体提取物（BPE，100µg/ml）促进SCs增殖。待细胞80%融合时准备病毒转染。
1.2.2Ad-BDNF转染雪旺细胞含BDNF基因的重组腺病毒（Ad-BDNF）购自中国军事医学科学院基础医学研究所。在进行转染前，按照M.O.I分别为0（即未经感染的正常SCs）、50、100、200和400 pfu/cell计算所需的病毒量，用无血清DMEM培养液稀释Ad-BDNF原液后取相应体积。将病毒加入孔中，轻柔摇晃培养板使病毒平坦的扩散到单层生长细胞上。37℃、5%CO2孵箱中培养72小时。将各组SCs用 2.5 g/L 胰酶消化制备成细胞悬液，1000 r/min 离心10 min，PBS 洗涤 1 次，收集细胞沉淀备用。
1.2.3总RNA提取及纯度分析按试剂盒说明采用 Trizol液一步法裂解细胞，提取总 RNA。取RNA样品5 μL用995 μL DEPC水稀释（1：200）后，用紫外分光光度计测定 260 nm和 280 nm处的吸光度。每个样品读取三次，取均值。RNA样品浓度=200×A260×40mg/L。以A260/A280比值确定RNA纯度，比值应在 1.8~2.0 范围内。连续进行三次实验，以消除非特异性差异。
1.2.4cDNA引物设计BDNF cDNA特异性引物序列参照文献设计[5]，由上海生工生物技术公司合成。
上游引物为5’-CACTCTGACCCTGCCCGCCGAG，
下游引 物为5’-GCATTTAGGTGACACTATAG-3’，扩增片段长度为 430 bp。
1.2.5 RT-PCR 反应试验按Invitrogen公司的RT-PCR反应试剂盒说明书进行。反应条件：94℃变性 1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1min，30个循环。
1.3统计学分析
应用SPSS 13.0统计软件，两组间同一时间点采用配对t检验，同组内各时间点采用SNK-q检验。
2结果
2.1光镜观察
原代培养雪旺细胞成功后，经阿糖胞苷、Geneticin联合作用，BPE促增殖，传代，镜下见第二代雪旺细胞呈典型的长梭形、双极状，“肩并肩”排列生长。感染后4小时，镜下未见有任何细胞形态变化，状态良好；24小时，镜下见雪旺细胞仍呈双极状、“肩并肩”排列生长；48小时，镜下观察雪旺细胞亦无明显的形态学变化，长势良好。
2.2感染后SCs中BDNF mRNA的表达
提取感染各组和对照组SCs的总RNA，经RT-PCR后均扩增出了约430 bp大小的基因片段，与构建的表达单元大小一致。经灰度分析可知，其中DNA 条带灰度以MOI为200组为著，正常SCs对照组最低（图1）。此结果证实，经 Ad-BDNF 感染后的SCs有外源性 BDNF mRNA 的表达，且表达量明显高于正常SCs；MOI 为 200 感染时，外源性 BDNF 基因转移效率最高。
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图1：不同MOI感染SC后BDNF mRNA的表达
（0：正常SC对照组；1：MOI＝50； 2：MOI＝100；3：MOI＝200；4：MOI＝400；M：DNA Marker）
2.3ELISA检测培养液上清中BDNF的表达
从感染后3 d开始，感染后SCs培养液上清中BDNF表达量即开始出现升高，6~12 d升高趋势明显，15~21 d 升高趋势减缓，但BDNF表达量能够维持在较高水平。对照组在各时间点BDNF 表达量均明显低于感染组（P<0.01）（表1）。
表1在不同时间点感染后SC和正常SC培养液上清中BDNF的表达（±s，n=10，μg/L，MOI=200）
时间点（d） 正常SC对照组 感染后 SC 组 P值
3 0.31±0.07 0.63±0.11 <0.01
6 0.41±0.12 0.90±0.13 <0.01
9 0.47±0.13 1.52±0.14 <0.01
12 0.53±0.11 3.18±0.15 <0.01
15 0.56±0.12 3.39±0.15 <0.01
18 0.61±0.12 3.45±0.19 <0.01
21 0.65±0.11 3.57±0.16 <0.01
3讨 论
目前用于感染细胞的病毒载体主要有腺病毒载体系统和逆转录病毒载体系统。其中后者只能感染正在分裂的细胞，并且有插入突变及激活癌基因的危险，繁殖滴度低，故不太适合于体内基因治疗。而腺病毒载体系统具有稳定、安全、滴度高和宿主范围广等优点，还能感染非分裂期细胞，可直接体内应用，适于临床神经系统的基因治疗[6]。在基因转移效率和蛋白表达效率的平衡点上我们选择了腺病毒载体，它不仅能够感染包括神经元细胞和胶质细胞在内的多种细胞，而且感染效率高，容易将外源性基因片段转移到易感细胞中[7]。曹延林等[8]用逆转录病毒BDNF基因成功感染脊髓神经干细胞。因此，我们尝试利用重组腺病毒BDNF基因感染体外培养的SC，以期能进一步应用于周围神经的损伤修复。
我们采用解剖显微镜下机械性剥除神经外膜与束膜、差速贴壁法、阿糖胞苷与Geneticin联合应用纯化、BPE促进雪旺细胞增殖，可以获得纯度90%以上大量雪旺细胞[9]。
Ad-BDNF感染的SCs，RT-PCR检测到BDNF mRNA 的表达，且表达量明显高于正常SCs；ELISA法检测Ad-BDNF感染后SC培养液上清中高度表达BDNF，而正常SCs对照组未检测到BDNF，说明外源性BDNF基因确实转移到SCs体内，并经转录、翻译，最终得以表达。与文献报道的结果相符[10]。Ad-BDNF在MOI为200时转移BDNF基因效率最高，这可能与制备的Ad-BDNF本身性质以及 SD大鼠源性SCs的易感性有关。
总之，通过重组腺病毒介导外源性 BDNF 基因的转移，可以获得能够长时间高度表达BDNF的SC，这将为进一步修复周围神经损伤和保护受损神经元提供保证。此为应用重组腺病毒载体携带脑源性神经生长因子基因转染雪旺细胞促进损伤神经修复奠定了试验基础，探索了基因治疗外周神经损伤的新途径。
参考文献
[1] 韩岩，汤朝伍，王剑波，等.利用Geneticin纯化雪旺细胞的实验研究[J].中华显微外科杂志，1997，20（4）：277-280.
[2] 张勇杰，金岩，聂鑫，等.多步法分离和纯化雪旺细胞的实验研究[J].中华神经外科疾病研究杂志，2002，l（4）：347-350.
[3] 曹延林，罗卓荆，叶正旭.基因重组BDNF感染脊髓神经干细胞及其表达[J].中国矫形外科杂志，2005，l3（17）：1326-1328.