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摘要 [目的]鉴定聚乙烯醇降解菌HK1并研究其降解特性。[方法]以一株能以聚乙烯醇为唯一碳源生长的细菌HK1为出发菌株，通过形态观察和生理生化试验对其进行鉴定，研究其对几种实验室常用抗生素的抗性，并通过摇瓶试验研究其降解特性。[结果]经鉴定，该菌确定为解淀粉芽孢杆菌属细菌，30 ℃、180 r/min摇床培养后，对培养基中PVA（1 g/L）的降解率达36.26%。HK1降解PVA的环境最优条件如下：温度为30 ℃，底物浓度为1 g/L，pH 8.0，酵母粉添加量为2 g/L。[结论]研究结果为系统研究该菌株提供了参考。
关键词聚乙烯醇；解淀粉芽孢杆菌；菌株鉴定；生物降解
中图分类号X172文献标识码
A文章编号0517-6611（2017）22-0005-04
Abstract[Objective] The aim was to identify a polyvinyl alcohol degradable bacteria HK1 and study its degradation character.[Method] We took a strain HK1 which could grow with polyvinyl alcohol as the only carbon source，identified it through its morphology and physiochemical characteristics，studied the resistance to several kinds of antibiotics which were commonly used in the laboratory，and studied its degradation character through shake flask test.[Result] According to its morphology，physiochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis，HK1 was identified as Bacillus amyloliquefaciens.It could degrade 36.26% of PVA （1 g/L） after culturing at 30 ℃，180 r/min in shaking flasks.The optimal conditions for PVA biodegradation by the obtained strain were as followed：30 ℃，1 g/L PVA，pH 8.0，and 2 g/L yeast.[Conclusion] The results can provide reference for further research of the strain.
Key wordsPolyvinyl alcohol；Bacillus amyloliquefaciens；Identification；Biodegradation
聚乙烯醇（簡稱PVA）作为一种具有独特良好性能且可生物降解的高分子材料受到人们关注，被认为是很富前景的化工原料之一，被广泛应用于各个领域，涉及农业、纺织、医疗、食品、建筑和高分子化工等行业，在全球范围内的产量和消费需求都在迅速增加[1-2]。虽然PVA本身无毒性，但具有较大的表面活性，能在水中形成大量的泡沫，影响水体富氧，从而抑制甚至破坏水生生物的呼吸活动[3]，所以废水中的PVA必须经处理后才能排放。PVA是可被某些细菌作为唯一碳源利用的乙烯基聚合物[4-9]，自20世纪70年代以来，国内外对PVA生化降解的研究十分活跃，已经分离出许多降解PVA的微生物[10]。分离PVA降解菌，扩大培养后直接用于PVA废水处理，或者投加到活性污泥系统中的生物强化技术已成为目前研究的热点[11]。由于PVA降解菌在大自然中并不广泛存在，因此，进一步筛选高效降解PVA的菌种并提高其降解效率有着十分重要的研究意义。
西北农林科技大学生命科学学院获赠一株对PVA有着较高降解效率的菌株HK1，赠送者仅对该菌株进行了16S rDNA鉴定（16S rDNA序列经比对后暂定该菌为解淀粉芽孢杆菌属）并上传了序列。因国内外文献关于解淀粉芽孢杆菌对PVA的降解研究鲜有报道，笔者对该菌株的种属进行了生物学特性鉴定，研究了该菌对几种实验室常用抗生素的抗性，并对其降解特性进行了研究，以期为该菌的后续研究提供基础资料。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株来源。
菌株Bacillus amyloliquefaciens HK1由西北农林科技大学植物保护学院胡小平教授赠送，菌株的16S rDNA GenBank登录号为AB279736。
1.1.2培养基。LB培养基：酵母粉 5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L（固体培养基再加入10%琼脂粉），蒸馏水补齐，pH 7.2。
PVA基础培养基：PVA 1.00 g/L，K2HPO4 1.60 g/L，KH2PO4 0.20 g/L，MgSO4 0.05 g/L，CaCl2 0.05 g/L，FeSO4 0.02 g/L，NaCl 0.02 g/L，NH4NO3 0.20 g/L，蒸馏水补齐，pH 7.2。固体培养基：在相应液体培养基中加入1.5%琼脂粉。
1.1.3试剂。PVA1750（分析纯）、硼酸、I2、KI、甘油、75%乙醇、葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、3% H2O2溶液、浓硫酸、2%氨水、2% AgNO3溶液、脱脂棉或滤纸、草酸铵结晶紫或石碳酸复红、NaOH、MgSO4、无水CaCl2、FeSO4·7H2O、NaCl、蒸馏水。I2-KI溶液：I2 1 g，KI 8 g，H2O 100 mL。 1.1.4主要仪器。培养皿（9 cm直径）、三角瓶（100 mL）、量筒（50 mL）、容量瓶（50 mL）、接种环、移液枪（100、200、1 000 μL）、比色皿、天平、恒温振荡摇床、紫外分光测度计、离心机、恒温培养箱、恒温水浴锅、离子镀膜仪（JEOL）、场发射扫描电子显微镜（Hitachi Japan）。
1.2方法
1.2.1菌种活化及菌悬液制备。将-80 ℃下保存的菌株HK1取100 μL接种于LB斜面培养基，30 ℃活化18～24 h并保存在4 ℃冰箱内。挑取活化好的菌落接种于LB液体培养基，180 r/min、30 ℃摇床培养12 h。离心收集菌体，用磷酸盐缓冲液洗菌体3次后重悬，制成菌悬液，调节菌体浓度，使OD600在0.8左右。每次试验前，从4 ℃保存的斜面上转接新制菌悬液，每个月重新制备斜面保存菌种。
1.2.2菌株鉴定。 为了确认获赠菌株的种属信息正误，对HK1进行形态观察、16S rDNA序列测序、生理生化实验[12]等，確定其分类学地位。
1.2.2.1菌落形态观察。将培养好的HK1菌液进行适当稀释，取10 μL均匀涂布于LB固体培养基中，并将培养皿置于30 ℃培养，待培养皿中长出适当大小的单菌落后观察其菌落形态特征。
1.2.2.2菌株形态电镜观察。
将HK1菌株接种于固体培养基上培养至肉眼可见菌落形态后，在菌落上滴加5 μL无菌水，用灼烧灭菌的接种针挑散菌落。用干净的盖玻片覆盖水面，使散落在水中的菌体与盖玻片接触。提起盖玻片使其风干，待玻片表面没有流动水滴后将盖玻片放入3%戊二醛中，4 ℃过夜固定。依次用30%、50%、60%、70%、80%、90%及无水乙醇梯度脱水，每梯度浸泡10 min 2次。二氧化碳临界干燥法过夜干燥。将干燥好的玻片粘到观察台上，使用离子镀膜仪为玻璃片表面覆盖一层金属铂使其导电，使用扫描电镜观察菌体形态。
1.2.2.3菌株16S rDNA序列测序。
采用细菌基因组DNA提取试剂盒对HK1菌株的总DNA进行提取。分别以细菌的16S rDNA基因通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′（上海英骏生物技术有限公司合成）为正、反向引物，对该菌株的16S rDNA进行PCR扩增。产物送上海英骏生物技术有限公司纯化测序。测序结果使用GenBank进行Blast比对分析、整理后使用MEGA 6.0软件构建系统发育树，验证菌株。
1.2.2.4生理生化特性。
参照《伯杰细菌鉴定手册》[13]对菌株HK1进行生理生化试验，包括糖类发酵试验、淀粉水解试验、明胶水解试验、石蕊牛奶试验、甲基红（MR）、接触酶试验、NaCl耐受性试验、纤维素水解、好氧性检测和半固体穿刺试验。
1.2.3对几种实验室常用抗生素的耐受性检测。
1.2.3.1含抗生素的培养基制备。
灭菌后的LB固体培养基冷却至45 ℃左右时，在超净台上按梯度分别向培养基内添加抗生素至终浓度（mg/L）为2.5，5.0，50.0，100.0，200.0，300.0，…，添加完毕后摇匀培养基倒平板，每种抗生素每个浓度设置3个平板重复，冷却后备用。另外使用未添加抗生素的LB固体培养基为空白平板对照组。
1.2.3.2菌株HK1对不同抗生素的耐受检测。
吸取5 μL活化菌株制成的菌悬液涂布于抗生素平板及空白平板上，30 ℃倒置培养，最长培养3 d以免抗生素失效，观察并记录菌株生长情况。对在某抗生素各浓度平板上生长正常的，逐渐增加该抗生素浓度直至获得最大耐受浓度。
1.2.4HK1生长及PVA降解率测定。
活化好的菌株HK1接种于50 mL PVA液体培养基中，30 ℃、180 r/min培养，每隔6 h取培养液测定OD600，并另取一定量培养液进行硼酸-碘碘化钾显色反应（具体步骤见“1.2.6.2”），计算其降解率。
1.2.5降解条件研究。
1.2.5.1温度对PVA降解的影响。
将活化菌株按照5%接种于PVA液体培养基，置于不同温度（20、25、30、35、40、45 ℃）下180 r/min振荡培养60 h，计算菌株对PVA的降解率。
1.2.5.2pH对PVA降解的影响。
将活化菌株按照5%接种于不同初始pH（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0）的PVA液体培养基中，在30 ℃、180 r/min下培养60 h，计算菌株对PVA的降解率。
1.2.5.3初始PVA浓度对PVA降解的影响。
将活化菌株按照5%接种于含不同初始PVA浓度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 g/L）的PVA液體培养基中，30 ℃培养60 h，计算菌株对PVA的降解率。为防止其他碳源影响，此处使用的培养基中不添加酵母粉。
1.2.5.4酵母粉浓度对PVA降解的影响。
将活化菌株按照5%接种于含不同浓度（0.5、1.0、2.0、3.0和4.0 g/L）酵母粉的PVA液体培养基中，置于30 ℃培养60 h，计算菌株对PVA的降解率。
1.2.6分析方法。
1.2.6.1菌体生物量测定。
将活化好的菌株HK1接种于PVA液体培养基中，30 ℃、180 r/min振荡培养，每隔6 h取样于比色皿中，用分光光度计测定OD600。
1.2.6.2PVA浓度测定及降解率计算。碘-硼酸试剂法[14]：取1.2 mL培养液于1.5 mL离心管中，5 000 r/min室温离心20 min，取上清1.0 mL于50 mL容量瓶中，加入15.0 mL 25 g/L硼酸溶液、1.5 mL I2-KI溶液，定容。室温避光反应10 min生成绿色溶液，于690 nm波长处测定吸光度。与标准曲线进行换算，再乘以稀释度得出残留PVA浓度。降解率计算[14]： 降解率=（A0-A1）/A0×100%
式中，A0為空白试样（即未接菌的空白培养基）的吸光度；A1为降解样的吸光度。
2结果与分析
2.1菌株鉴定
2.1.1菌落形态特征。将涂布有菌株HK1的LB固体培养皿在30 ℃下培养25 h后取出，对菌落形态进行观察。HK1在LB固体培养基上的菌落呈不规则形状，浅黄色蜡质，不透明，表面干燥有褶皱，菌落中部隆起，边缘呈锯齿状。
2.1.2菌株形态电镜观察。
扫描电镜图（图1左）中可以清晰地看到HK1的菌体形态为椭圆杆状，长度约为28 μm，直径约为6 μm，图1右为菌群状态。
2.1.3菌株生理生化特性。HK1菌株的生理生化特性见表1。
2.1.4菌株16S rDNA序列测序。
16S rDNA序列测序结果表明，菌株HK1与Bacillus amyloliquefaciens的序列相似性达100%，结合生理生化、菌落菌株形态，可以确定HK1为解淀粉芽孢杆菌属，验证了捐赠者的16S rDNA鉴定结果。菌株HK1的系统发育树见图2。
2.2几种抗生素对HK1菌株的致死浓度检测
通过在含不同浓度不同抗生素平板上涂布菌株观察生长状况，并以无抗生素平板上的菌株生长情况为对照，检测各抗生素对HK1菌株的致死浓度，结果见表2。
45卷22期刘云柯等聚乙烯醇降解菌HK1菌株鉴定与降解特性
2.3HK1生长曲线及PVA降解过程
活化好的菌株HK1接种于50 mL液体PVA培养基中，30 ℃、180 r/min每隔6 h取样1 mL测定OD600和发酵液中PVA残余浓度，并计算其降解率。由图3可知，HK1菌株在经过约18 h后，其菌体浓度即处于最大值，随后进入稳定期，OD600为0.265。菌株降解PVA情况：该菌株在60 h后PVA降解率达到最大，降解率为36.26%。
2.4降解条件研究
2.4.1温度对PVA降解的影响。
不同温度对微生物HK1降解PVA有明显的影响。由图4可知，在20～30 ℃时，随着温度的升高，菌株对PVA的降解率也随之升高，当温度升到30 ℃时，降解率达到最大，为15.57%。在30～45 ℃时，随着温度的升高，降解率逐渐降低。由此可知，HK1菌株降解PVA的最适温度为30 ℃。
2.4.2pH对PVA降解的影响。
不同初始pH对微生物HK1降解PVA影响很大（图5）。初始pH在6.0～9.0时，菌株对PVA均有一定的降解能力。初始pH在8.0时PVA的降解率最大。可见，HK1菌株在中性偏微碱性环境中对PVA降解效果最好，在酸性或过碱性环境中可能会抑制其生长进而影响其对PVA的降解能力。
2.4.3PVA浓度对PVA降解的影响。
碳源是菌体合成自身骨架的主要物质来源，是影响菌体生长和代谢产物合成的关键因素。由图6可知，不同起始PVA浓度对微生物HK1降解率的影響很大。PVA起始浓度在0.5～1.0 g/L时，菌株对PVA的降解率随浓度增大而升高，且起始浓度为1.0 g/L时降解率达到最大，为22.31%。当起始浓度大于1.0 g/L后，该菌株的降解效率随浓度增大而明显降低。有关研究表明，培养液中PVA浓度增加会导致溶液黏度的增加，可能造成培养基的溶氧量小于细胞生长代谢的需要量，从而阻碍了菌体的生长和产酶[14]。
2.4.4酵母粉浓度对PVA降解的影响。
添加有机氮源不仅有利于菌体的生长，并且能提供一些生长因子显著提高菌体对PVA的降解能力[15]。由图7可知，添加的酵母粉浓度在0.5～2.0 g/L时，菌株对PVA的降解率随浓度增大而明显升高，且浓度为2.0 g/L时降解率达到最大，为36.16%。当酵母粉浓度超过2.0 g/L后，HK1菌株对PVA的降解率有所降低。经分析，添加一定质量的酵母粉对菌株降解PVA有明显的促进作用，而酵母粉本身成分复杂，添加量过大可能导致菌株优先利用其中的碳源进行生长而降低对PVA的利用，导致降解率下降。
3结论
西北农林科技大学植物保护学院胡小平教授获赠的一株能以PVA为唯一碳源和能源生长的菌株HK1，经鉴定确认其为解淀粉芽孢杆菌属（Bacillus amyloliquefaciens），其在实验室培养条件下能显著降解PVA，60 h的PVA降解率可达36.26%（1 g/L）。
研究了HK1的降解条件，包括温度、pH、初始PVA浓度和酵母膏浓度对其降解PVA的影响。结果表明，其最适温度、pH、初始PVA浓度和酵母粉浓度分别为30 ℃、8.0、1.0 g/L和2.0 g/L。
参考文献
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关键词聚乙烯醇；解淀粉芽孢杆菌；菌株鉴定；生物降解
中图分类号X172文献标识码
A文章编号0517-6611（2017）22-0005-04
Abstract[Objective] The aim was to identify a polyvinyl alcohol degradable bacteria HK1 and study its degradation character.[Method] We took a strain HK1 which could grow with polyvinyl alcohol as the only carbon source，identified it through its morphology and physiochemical characteristics，studied the resistance to several kinds of antibiotics which were commonly used in the laboratory，and studied its degradation character through shake flask test.[Result] According to its morphology，physiochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis，HK1 was identified as Bacillus amyloliquefaciens.It could degrade 36.26% of PVA （1 g/L） after culturing at 30 ℃，180 r/min in shaking flasks.The optimal conditions for PVA biodegradation by the obtained strain were as followed：30 ℃，1 g/L PVA，pH 8.0，and 2 g/L yeast.[Conclusion] The results can provide reference for further research of the strain.
Key wordsPolyvinyl alcohol；Bacillus amyloliquefaciens；Identification；Biodegradation
聚乙烯醇（簡稱PVA）作为一种具有独特良好性能且可生物降解的高分子材料受到人们关注，被认为是很富前景的化工原料之一，被广泛应用于各个领域，涉及农业、纺织、医疗、食品、建筑和高分子化工等行业，在全球范围内的产量和消费需求都在迅速增加[1-2]。虽然PVA本身无毒性，但具有较大的表面活性，能在水中形成大量的泡沫，影响水体富氧，从而抑制甚至破坏水生生物的呼吸活动[3]，所以废水中的PVA必须经处理后才能排放。PVA是可被某些细菌作为唯一碳源利用的乙烯基聚合物[4-9]，自20世纪70年代以来，国内外对PVA生化降解的研究十分活跃，已经分离出许多降解PVA的微生物[10]。分离PVA降解菌，扩大培养后直接用于PVA废水处理，或者投加到活性污泥系统中的生物强化技术已成为目前研究的热点[11]。由于PVA降解菌在大自然中并不广泛存在，因此，进一步筛选高效降解PVA的菌种并提高其降解效率有着十分重要的研究意义。
西北农林科技大学生命科学学院获赠一株对PVA有着较高降解效率的菌株HK1，赠送者仅对该菌株进行了16S rDNA鉴定（16S rDNA序列经比对后暂定该菌为解淀粉芽孢杆菌属）并上传了序列。因国内外文献关于解淀粉芽孢杆菌对PVA的降解研究鲜有报道，笔者对该菌株的种属进行了生物学特性鉴定，研究了该菌对几种实验室常用抗生素的抗性，并对其降解特性进行了研究，以期为该菌的后续研究提供基础资料。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株来源。
菌株Bacillus amyloliquefaciens HK1由西北农林科技大学植物保护学院胡小平教授赠送，菌株的16S rDNA GenBank登录号为AB279736。
1.1.2培养基。LB培养基：酵母粉 5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L（固体培养基再加入10%琼脂粉），蒸馏水补齐，pH 7.2。
PVA基础培养基：PVA 1.00 g/L，K2HPO4 1.60 g/L，KH2PO4 0.20 g/L，MgSO4 0.05 g/L，CaCl2 0.05 g/L，FeSO4 0.02 g/L，NaCl 0.02 g/L，NH4NO3 0.20 g/L，蒸馏水补齐，pH 7.2。固体培养基：在相应液体培养基中加入1.5%琼脂粉。
1.1.3试剂。PVA1750（分析纯）、硼酸、I2、KI、甘油、75%乙醇、葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、3% H2O2溶液、浓硫酸、2%氨水、2% AgNO3溶液、脱脂棉或滤纸、草酸铵结晶紫或石碳酸复红、NaOH、MgSO4、无水CaCl2、FeSO4·7H2O、NaCl、蒸馏水。I2-KI溶液：I2 1 g，KI 8 g，H2O 100 mL。 1.1.4主要仪器。培养皿（9 cm直径）、三角瓶（100 mL）、量筒（50 mL）、容量瓶（50 mL）、接种环、移液枪（100、200、1 000 μL）、比色皿、天平、恒温振荡摇床、紫外分光测度计、离心机、恒温培养箱、恒温水浴锅、离子镀膜仪（JEOL）、场发射扫描电子显微镜（Hitachi Japan）。
1.2方法
1.2.1菌种活化及菌悬液制备。将-80 ℃下保存的菌株HK1取100 μL接种于LB斜面培养基，30 ℃活化18～24 h并保存在4 ℃冰箱内。挑取活化好的菌落接种于LB液体培养基，180 r/min、30 ℃摇床培养12 h。离心收集菌体，用磷酸盐缓冲液洗菌体3次后重悬，制成菌悬液，调节菌体浓度，使OD600在0.8左右。每次试验前，从4 ℃保存的斜面上转接新制菌悬液，每个月重新制备斜面保存菌种。
1.2.2菌株鉴定。 为了确认获赠菌株的种属信息正误，对HK1进行形态观察、16S rDNA序列测序、生理生化实验[12]等，確定其分类学地位。
1.2.2.1菌落形态观察。将培养好的HK1菌液进行适当稀释，取10 μL均匀涂布于LB固体培养基中，并将培养皿置于30 ℃培养，待培养皿中长出适当大小的单菌落后观察其菌落形态特征。
1.2.2.2菌株形态电镜观察。
将HK1菌株接种于固体培养基上培养至肉眼可见菌落形态后，在菌落上滴加5 μL无菌水，用灼烧灭菌的接种针挑散菌落。用干净的盖玻片覆盖水面，使散落在水中的菌体与盖玻片接触。提起盖玻片使其风干，待玻片表面没有流动水滴后将盖玻片放入3%戊二醛中，4 ℃过夜固定。依次用30%、50%、60%、70%、80%、90%及无水乙醇梯度脱水，每梯度浸泡10 min 2次。二氧化碳临界干燥法过夜干燥。将干燥好的玻片粘到观察台上，使用离子镀膜仪为玻璃片表面覆盖一层金属铂使其导电，使用扫描电镜观察菌体形态。
1.2.2.3菌株16S rDNA序列测序。
采用细菌基因组DNA提取试剂盒对HK1菌株的总DNA进行提取。分别以细菌的16S rDNA基因通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′（上海英骏生物技术有限公司合成）为正、反向引物，对该菌株的16S rDNA进行PCR扩增。产物送上海英骏生物技术有限公司纯化测序。测序结果使用GenBank进行Blast比对分析、整理后使用MEGA 6.0软件构建系统发育树，验证菌株。
1.2.2.4生理生化特性。
参照《伯杰细菌鉴定手册》[13]对菌株HK1进行生理生化试验，包括糖类发酵试验、淀粉水解试验、明胶水解试验、石蕊牛奶试验、甲基红（MR）、接触酶试验、NaCl耐受性试验、纤维素水解、好氧性检测和半固体穿刺试验。
1.2.3对几种实验室常用抗生素的耐受性检测。
1.2.3.1含抗生素的培养基制备。
灭菌后的LB固体培养基冷却至45 ℃左右时，在超净台上按梯度分别向培养基内添加抗生素至终浓度（mg/L）为2.5，5.0，50.0，100.0，200.0，300.0，…，添加完毕后摇匀培养基倒平板，每种抗生素每个浓度设置3个平板重复，冷却后备用。另外使用未添加抗生素的LB固体培养基为空白平板对照组。
1.2.3.2菌株HK1对不同抗生素的耐受检测。
吸取5 μL活化菌株制成的菌悬液涂布于抗生素平板及空白平板上，30 ℃倒置培养，最长培养3 d以免抗生素失效，观察并记录菌株生长情况。对在某抗生素各浓度平板上生长正常的，逐渐增加该抗生素浓度直至获得最大耐受浓度。
1.2.4HK1生长及PVA降解率测定。
活化好的菌株HK1接种于50 mL PVA液体培养基中，30 ℃、180 r/min培养，每隔6 h取培养液测定OD600，并另取一定量培养液进行硼酸-碘碘化钾显色反应（具体步骤见“1.2.6.2”），计算其降解率。
1.2.5降解条件研究。
1.2.5.1温度对PVA降解的影响。
将活化菌株按照5%接种于PVA液体培养基，置于不同温度（20、25、30、35、40、45 ℃）下180 r/min振荡培养60 h，计算菌株对PVA的降解率。
1.2.5.2pH对PVA降解的影响。
将活化菌株按照5%接种于不同初始pH（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0）的PVA液体培养基中，在30 ℃、180 r/min下培养60 h，计算菌株对PVA的降解率。
1.2.5.3初始PVA浓度对PVA降解的影响。
将活化菌株按照5%接种于含不同初始PVA浓度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 g/L）的PVA液體培养基中，30 ℃培养60 h，计算菌株对PVA的降解率。为防止其他碳源影响，此处使用的培养基中不添加酵母粉。
1.2.5.4酵母粉浓度对PVA降解的影响。
将活化菌株按照5%接种于含不同浓度（0.5、1.0、2.0、3.0和4.0 g/L）酵母粉的PVA液体培养基中，置于30 ℃培养60 h，计算菌株对PVA的降解率。
1.2.6分析方法。
1.2.6.1菌体生物量测定。
将活化好的菌株HK1接种于PVA液体培养基中，30 ℃、180 r/min振荡培养，每隔6 h取样于比色皿中，用分光光度计测定OD600。
1.2.6.2PVA浓度测定及降解率计算。碘-硼酸试剂法[14]：取1.2 mL培养液于1.5 mL离心管中，5 000 r/min室温离心20 min，取上清1.0 mL于50 mL容量瓶中，加入15.0 mL 25 g/L硼酸溶液、1.5 mL I2-KI溶液，定容。室温避光反应10 min生成绿色溶液，于690 nm波长处测定吸光度。与标准曲线进行换算，再乘以稀释度得出残留PVA浓度。降解率计算[14]： 降解率=（A0-A1）/A0×100%
式中，A0為空白试样（即未接菌的空白培养基）的吸光度；A1为降解样的吸光度。
2结果与分析
2.1菌株鉴定
2.1.1菌落形态特征。将涂布有菌株HK1的LB固体培养皿在30 ℃下培养25 h后取出，对菌落形态进行观察。HK1在LB固体培养基上的菌落呈不规则形状，浅黄色蜡质，不透明，表面干燥有褶皱，菌落中部隆起，边缘呈锯齿状。
2.1.2菌株形态电镜观察。
扫描电镜图（图1左）中可以清晰地看到HK1的菌体形态为椭圆杆状，长度约为28 μm，直径约为6 μm，图1右为菌群状态。
2.1.3菌株生理生化特性。HK1菌株的生理生化特性见表1。
2.1.4菌株16S rDNA序列测序。
16S rDNA序列测序结果表明，菌株HK1与Bacillus amyloliquefaciens的序列相似性达100%，结合生理生化、菌落菌株形态，可以确定HK1为解淀粉芽孢杆菌属，验证了捐赠者的16S rDNA鉴定结果。菌株HK1的系统发育树见图2。
2.2几种抗生素对HK1菌株的致死浓度检测
通过在含不同浓度不同抗生素平板上涂布菌株观察生长状况，并以无抗生素平板上的菌株生长情况为对照，检测各抗生素对HK1菌株的致死浓度，结果见表2。
45卷22期刘云柯等聚乙烯醇降解菌HK1菌株鉴定与降解特性
2.3HK1生长曲线及PVA降解过程
活化好的菌株HK1接种于50 mL液体PVA培养基中，30 ℃、180 r/min每隔6 h取样1 mL测定OD600和发酵液中PVA残余浓度，并计算其降解率。由图3可知，HK1菌株在经过约18 h后，其菌体浓度即处于最大值，随后进入稳定期，OD600为0.265。菌株降解PVA情况：该菌株在60 h后PVA降解率达到最大，降解率为36.26%。
2.4降解条件研究
2.4.1温度对PVA降解的影响。
不同温度对微生物HK1降解PVA有明显的影响。由图4可知，在20～30 ℃时，随着温度的升高，菌株对PVA的降解率也随之升高，当温度升到30 ℃时，降解率达到最大，为15.57%。在30～45 ℃时，随着温度的升高，降解率逐渐降低。由此可知，HK1菌株降解PVA的最适温度为30 ℃。
2.4.2pH对PVA降解的影响。
不同初始pH对微生物HK1降解PVA影响很大（图5）。初始pH在6.0～9.0时，菌株对PVA均有一定的降解能力。初始pH在8.0时PVA的降解率最大。可见，HK1菌株在中性偏微碱性环境中对PVA降解效果最好，在酸性或过碱性环境中可能会抑制其生长进而影响其对PVA的降解能力。
2.4.3PVA浓度对PVA降解的影响。
碳源是菌体合成自身骨架的主要物质来源，是影响菌体生长和代谢产物合成的关键因素。由图6可知，不同起始PVA浓度对微生物HK1降解率的影響很大。PVA起始浓度在0.5～1.0 g/L时，菌株对PVA的降解率随浓度增大而升高，且起始浓度为1.0 g/L时降解率达到最大，为22.31%。当起始浓度大于1.0 g/L后，该菌株的降解效率随浓度增大而明显降低。有关研究表明，培养液中PVA浓度增加会导致溶液黏度的增加，可能造成培养基的溶氧量小于细胞生长代谢的需要量，从而阻碍了菌体的生长和产酶[14]。
2.4.4酵母粉浓度对PVA降解的影响。
添加有机氮源不仅有利于菌体的生长，并且能提供一些生长因子显著提高菌体对PVA的降解能力[15]。由图7可知，添加的酵母粉浓度在0.5～2.0 g/L时，菌株对PVA的降解率随浓度增大而明显升高，且浓度为2.0 g/L时降解率达到最大，为36.16%。当酵母粉浓度超过2.0 g/L后，HK1菌株对PVA的降解率有所降低。经分析，添加一定质量的酵母粉对菌株降解PVA有明显的促进作用，而酵母粉本身成分复杂，添加量过大可能导致菌株优先利用其中的碳源进行生长而降低对PVA的利用，导致降解率下降。
3结论
西北农林科技大学植物保护学院胡小平教授获赠的一株能以PVA为唯一碳源和能源生长的菌株HK1，经鉴定确认其为解淀粉芽孢杆菌属（Bacillus amyloliquefaciens），其在实验室培养条件下能显著降解PVA，60 h的PVA降解率可达36.26%（1 g/L）。
研究了HK1的降解条件，包括温度、pH、初始PVA浓度和酵母膏浓度对其降解PVA的影响。结果表明，其最适温度、pH、初始PVA浓度和酵母粉浓度分别为30 ℃、8.0、1.0 g/L和2.0 g/L。
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