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[摘要] 目的 探讨颅脑损伤后Pim-3的表达及其与细胞凋亡的关系。 方法 48只大鼠随机分为实验组与对照组。实验组大鼠制作重型颅脑损伤模型，对照组大鼠予以假手术处理，两组大鼠分别在伤后6、24、72 h及7 d免疫组化SP法检测Pim-3蛋白表达、TUNEL法检测细胞凋亡。 结果 重型颅脑损伤后大鼠脑组织Pim-3蛋白水平、细胞凋亡水平均较对照组明显升高，并在伤后24 h达到高峰，7 d后开始下降。 结论 Pim-3可能在颅脑损伤后细胞凋亡中起重要作用。
[关键词] 颅脑损伤；Pim-3；细胞凋亡
[中图分类号] R651.15 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2011）23-36-02
Study on the expression of Pim-3 after traumatic brain injury and the relationship between Pim-3 and apoptosis
WANG Xudong DAI Rufei HUANG Guangsu LI Ming HAN Dahe
Intensive Care Unit,the Second Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College,Xuzhou 221006,China
[Abstract] Objective To investigate the expression of Pim-3 and the relationship between Pim-3 and apoptosis of cell after severe traumatic brain injury. Methods 48 SD rats were randomly divided into experimental group and control group. Animal models were established in experimental group,while the control group was dealed with sham-operation,the expressions of Pim-3 were detected at the time of 6,24,72 h and 7 d by immunostaining assay using Streptavidin-Peroxidase mothed,and apoptosis of cell was evaluated by TUNEL. Results After severe TBI,the expression of Pim-3 and apoptosis in experimental group were significantly higher than that of the control group,he peak showed up 24 h after TBI,and decreased after 7 d. Conclusion Pim-3 may play an important role on the apoptosis after TBI.
[Key words] Traumatic brain injury;Pim-3;Apoptosis
细胞凋亡在颅脑损伤致神经元损伤中占据重要地位，目前关于颅脑损伤后神经细胞凋亡的分子生物学机制仍未完全明确。Pim-3是新近发现的凋亡抑制因子，其在颅脑损伤后表达水平及其与细胞凋亡的关系尚未见报道。本实验建立重型颅脑损伤动物模型，免疫组化SP法检测Pim-3蛋白表达、TUNEL法检测细胞凋亡水平，以探讨Pim-3表达与颅脑损伤后神经细胞细胞凋亡的关系。
1 材料与方法
1.1 实验动物
成年雄性SD大鼠48只，体重200~250 g，由徐州医学院动物实验中心提供，采用随机数字表随机分为实验组与对照组，每组各24只。
1.2 主要试剂
羊抗大鼠Pim-3抗体（Santa Cruz公司），SP免疫组化试剂盒，DAB试剂盒（北京中山生物工程公司），TUNEL试剂盒（美国Promega公司）。
1.3 动物模型制作
采用Feeney法制作大鼠脑外伤模型。大鼠苯巴比妥麻醉后固定于立体定向仪上。头皮正中切口并暴露右顶骨。以冠状缝后2 mm、中线旁开3 mm为中心开5 mm×5 mm骨窗。保持硬膜完整，对骨窗下右顶叶脑组织施以40 g重物自25 cm高
处沿滑杆垂直落下撞击制作重型颅脑损伤模型。对照组只作开骨窗处理。
1.4 Pim-3蛋白表达检测
Pim-3蛋白表达检测采用免疫组化链霉素抗生素-过氧化物酶（SP）法，5 μm连续切片。操作中加入一抗前用微波處理以促使抗原暴露。Pim-3工作浓度为1︰100。每张切片随机选取3个高倍视野（×200倍），图象分析系统（NYD-1000）分别测得3个视野积分光密度（integrated optical density，IOD）值后取平均值。
1.5 TUNEL法测定细胞凋亡
在上述各时点两组处死大鼠，脑组织常规制片后石蜡包埋。按照试剂盒说明操作，细胞核呈棕黄色为凋亡细胞。每张切片随即选取计算3个高倍视野，计算细胞总数和凋亡细胞数目。凋亡指数（AI）＝凋亡细胞数/细胞总数×100%。
1.6 统计学处理
采用SPSS10.0 统计软件处理，实验数据以（）表示，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）的LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组大鼠不同时间Pim-3表达水平
实验组大鼠颅脑损伤后6 h 即出现Pim-3的表达，72 h表达达到高峰，7 d后呈下降趋势，且各时点的表达水平均较对照组升高。见表1，图1~3。
2.2 两组大鼠不同时间细胞凋亡水平的比较
实验组大鼠颅脑损伤后6 h即出现细胞凋亡的显著上升，并在伤后72 h达到高峰，7 d后呈下降趋势，且各时点的表达水平均较对照组升高。见表2，图4~6。
3 讨论
颅脑外伤导致的神经细胞损伤机制可能包括细胞凋亡、生长相关蛋白生成减少等原因[1]。研究表明，颅脑损伤后神经细胞发生凋亡的机制如下：①Bcl-2/Bax家族的参与：Bcl-2是人体最主要的抗凋亡基因。Bax 属于Bcl-2 基因家族，编码的Bax 蛋白可与Bcl-2 形成异二聚体，对Bcl-2 产生阻抑作用。Bax/Bcl-2 之间的比例关系是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素。研究表明，颅脑损伤后Bcl-2的表达下降而Bax的表达增加是导致细胞凋亡的重要原因，而减少Bax的表达可以起到神经保护的作用[2-4]；②细胞色素C的作用：Satchell 等[5]的研究表明颅脑损伤后细胞色素C大量释放可引起细胞凋亡的增加，并认为细胞色素C 可以作为颅脑损伤后细胞凋亡水平的生物学标志；③Caspase蛋白酶家族：研究表明颅脑损伤后Caspase蛋白酶家族如Caspase-3、Caspase-8的表达增加，并诱导神经细胞凋亡[6-7]。
Pim（proviral integration of MMLV，Pim）蛋白家族因在莫罗尼鼠白血病病毒（moloney murine leukemia virus， MMLV的前病毒整合过程中被发现而得名，后被证实它是一组与钙/钙调蛋白调节激酶（calcium/cal-modulinre-gulated ki-nase，CAMK）相关的蛋白激酶家族。研究证实Pim蛋白家族对可以调节细胞的增殖和和凋亡，并可通过对Pim蛋白的调节而达到治疗某些肿瘤的作用[8]。
Pim蛋白家族有3個亚型，其中Pim-3最初由Feldman等以大鼠细胞系PC12去极化诱导的基因而被首先报道。Liu D 等[9-10]研究证明，Pim-3可通过多种途径如P38信号途径、TNF的调节等而增强细胞抗凋亡作用。
本研究结果显示颅脑损伤后实验组大鼠颅脑损伤后6 h 即出现Pim-3的表达，72 h表达达到高峰，7 d后呈下降趋势，且各时点的表达水平均较对照组升高。实验组大鼠颅脑损伤后6 h即出现细胞凋亡的显著上升并在伤后72 h达到高峰，7 d后呈下降趋势，且各时点的表达水平均较对照组升高。Pim-3的表达与细胞凋亡的表达有一定的时相相关性，笔者分析其原因是随着细胞凋亡的增加，机体动用自我调节机制，上调Pim-3的表达，以增强抗细胞凋亡的功能，从而减少神经细胞凋亡，保护神经组织。
通过实验，笔者认为Pim-3在颅脑损伤细胞凋亡机制中发挥重要的作用，调节Pim-3的表达有可能达到治疗颅脑损伤的目的。
[参考文献]
[1] 马冉冉，李光勤，王进平，等. 电针对脑缺血再灌注后大鼠脑缺血区生长相关蛋白-43与神经蛋白聚糖表达的影响[J].中国老年学杂志，2009，19（14）：2675-2678.
[2] Hoh NZ,Wagner AK,Alexander SA,et al. BCL2 genotypes: functional and neurobehavioral outcomes after severe traumatic brain injury[J].J Neurotrauma,2010,27(8):1413-1427.
[3] Park OH,Lee KJ,Rhyu IJ,et al.Bax-dependent and -independent death of motoneurons after facial nerve injury in adult mice[J].Eur J Neurosci,2007,26(6):1421-1432.
[4] Tehranian R,Rose ME,Vagni V,et al.Disruption of Bax protein prevents neuronal cell death but produces cognitive impairment in mice following traumatic brain injury[J].J Neurotrauma,2008,25(7):755-767.
[5] Satchell MA,Lai Y,Kochanek PM,et al.Cytochrome c, a biomarker of apoptosis, is increased in cerebrospinal fluid from infants with inflicted brain injury from child abuse[J].J Cereb Blood Flow Metab, 2005,25(7):919-927.
[6] Li LZ,Bao YJ,Zhao M.17beta-estradiol attenuates programmed cell death in cortical pericontusional zone following traumatic brain injury via upregulation of ERalpha and inhibition of caspase-3 activation[J]. Neurochem Int,2011,58(1):126-133.
[7] Zhang X,Graham SH,Kochanek PM.Caspase-8 expression andproteolysis in human brain after severe head injury[J].FASEB J,2008,17(10):1367-1369.
[8] Brault L,Gasser C,Bracher F,et al.PIM serine/threonine kinases in the pathogenesis and therapy of hematologic m alignancies and solid cancers[J].Haematologica,2010,95(6):1004-1015.
[9] Liu D,He M,Yi B,et al.Pim-3 protects against cardiomyocyte apoptosis in anoxia/reoxygenation injury via p38-mediated signal pathway[J].Int J Biochem Cell Biol,2009,41(11):2315-22.
[10] Yang H,Wang Y,Qian H,et al.Pim protein kinase-3 is regulated by TNF-α and promotes endothelial cell sprouting[J].Mol Cells,2011,32(3):235-241.
（收稿日期：2011-10-20）
[关键词] 颅脑损伤；Pim-3；细胞凋亡
[中图分类号] R651.15 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2011）23-36-02
Study on the expression of Pim-3 after traumatic brain injury and the relationship between Pim-3 and apoptosis
WANG Xudong DAI Rufei HUANG Guangsu LI Ming HAN Dahe
Intensive Care Unit,the Second Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College,Xuzhou 221006,China
[Abstract] Objective To investigate the expression of Pim-3 and the relationship between Pim-3 and apoptosis of cell after severe traumatic brain injury. Methods 48 SD rats were randomly divided into experimental group and control group. Animal models were established in experimental group,while the control group was dealed with sham-operation,the expressions of Pim-3 were detected at the time of 6,24,72 h and 7 d by immunostaining assay using Streptavidin-Peroxidase mothed,and apoptosis of cell was evaluated by TUNEL. Results After severe TBI,the expression of Pim-3 and apoptosis in experimental group were significantly higher than that of the control group,he peak showed up 24 h after TBI,and decreased after 7 d. Conclusion Pim-3 may play an important role on the apoptosis after TBI.
[Key words] Traumatic brain injury;Pim-3;Apoptosis
细胞凋亡在颅脑损伤致神经元损伤中占据重要地位，目前关于颅脑损伤后神经细胞凋亡的分子生物学机制仍未完全明确。Pim-3是新近发现的凋亡抑制因子，其在颅脑损伤后表达水平及其与细胞凋亡的关系尚未见报道。本实验建立重型颅脑损伤动物模型，免疫组化SP法检测Pim-3蛋白表达、TUNEL法检测细胞凋亡水平，以探讨Pim-3表达与颅脑损伤后神经细胞细胞凋亡的关系。
1 材料与方法
1.1 实验动物
成年雄性SD大鼠48只，体重200~250 g，由徐州医学院动物实验中心提供，采用随机数字表随机分为实验组与对照组，每组各24只。
1.2 主要试剂
羊抗大鼠Pim-3抗体（Santa Cruz公司），SP免疫组化试剂盒，DAB试剂盒（北京中山生物工程公司），TUNEL试剂盒（美国Promega公司）。
1.3 动物模型制作
采用Feeney法制作大鼠脑外伤模型。大鼠苯巴比妥麻醉后固定于立体定向仪上。头皮正中切口并暴露右顶骨。以冠状缝后2 mm、中线旁开3 mm为中心开5 mm×5 mm骨窗。保持硬膜完整，对骨窗下右顶叶脑组织施以40 g重物自25 cm高
处沿滑杆垂直落下撞击制作重型颅脑损伤模型。对照组只作开骨窗处理。
1.4 Pim-3蛋白表达检测
Pim-3蛋白表达检测采用免疫组化链霉素抗生素-过氧化物酶（SP）法，5 μm连续切片。操作中加入一抗前用微波處理以促使抗原暴露。Pim-3工作浓度为1︰100。每张切片随机选取3个高倍视野（×200倍），图象分析系统（NYD-1000）分别测得3个视野积分光密度（integrated optical density，IOD）值后取平均值。
1.5 TUNEL法测定细胞凋亡
在上述各时点两组处死大鼠，脑组织常规制片后石蜡包埋。按照试剂盒说明操作，细胞核呈棕黄色为凋亡细胞。每张切片随即选取计算3个高倍视野，计算细胞总数和凋亡细胞数目。凋亡指数（AI）＝凋亡细胞数/细胞总数×100%。
1.6 统计学处理
采用SPSS10.0 统计软件处理，实验数据以（）表示，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）的LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组大鼠不同时间Pim-3表达水平
实验组大鼠颅脑损伤后6 h 即出现Pim-3的表达，72 h表达达到高峰，7 d后呈下降趋势，且各时点的表达水平均较对照组升高。见表1，图1~3。
2.2 两组大鼠不同时间细胞凋亡水平的比较
实验组大鼠颅脑损伤后6 h即出现细胞凋亡的显著上升，并在伤后72 h达到高峰，7 d后呈下降趋势，且各时点的表达水平均较对照组升高。见表2，图4~6。
3 讨论
颅脑外伤导致的神经细胞损伤机制可能包括细胞凋亡、生长相关蛋白生成减少等原因[1]。研究表明，颅脑损伤后神经细胞发生凋亡的机制如下：①Bcl-2/Bax家族的参与：Bcl-2是人体最主要的抗凋亡基因。Bax 属于Bcl-2 基因家族，编码的Bax 蛋白可与Bcl-2 形成异二聚体，对Bcl-2 产生阻抑作用。Bax/Bcl-2 之间的比例关系是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素。研究表明，颅脑损伤后Bcl-2的表达下降而Bax的表达增加是导致细胞凋亡的重要原因，而减少Bax的表达可以起到神经保护的作用[2-4]；②细胞色素C的作用：Satchell 等[5]的研究表明颅脑损伤后细胞色素C大量释放可引起细胞凋亡的增加，并认为细胞色素C 可以作为颅脑损伤后细胞凋亡水平的生物学标志；③Caspase蛋白酶家族：研究表明颅脑损伤后Caspase蛋白酶家族如Caspase-3、Caspase-8的表达增加，并诱导神经细胞凋亡[6-7]。
Pim（proviral integration of MMLV，Pim）蛋白家族因在莫罗尼鼠白血病病毒（moloney murine leukemia virus， MMLV的前病毒整合过程中被发现而得名，后被证实它是一组与钙/钙调蛋白调节激酶（calcium/cal-modulinre-gulated ki-nase，CAMK）相关的蛋白激酶家族。研究证实Pim蛋白家族对可以调节细胞的增殖和和凋亡，并可通过对Pim蛋白的调节而达到治疗某些肿瘤的作用[8]。
Pim蛋白家族有3個亚型，其中Pim-3最初由Feldman等以大鼠细胞系PC12去极化诱导的基因而被首先报道。Liu D 等[9-10]研究证明，Pim-3可通过多种途径如P38信号途径、TNF的调节等而增强细胞抗凋亡作用。
本研究结果显示颅脑损伤后实验组大鼠颅脑损伤后6 h 即出现Pim-3的表达，72 h表达达到高峰，7 d后呈下降趋势，且各时点的表达水平均较对照组升高。实验组大鼠颅脑损伤后6 h即出现细胞凋亡的显著上升并在伤后72 h达到高峰，7 d后呈下降趋势，且各时点的表达水平均较对照组升高。Pim-3的表达与细胞凋亡的表达有一定的时相相关性，笔者分析其原因是随着细胞凋亡的增加，机体动用自我调节机制，上调Pim-3的表达，以增强抗细胞凋亡的功能，从而减少神经细胞凋亡，保护神经组织。
通过实验，笔者认为Pim-3在颅脑损伤细胞凋亡机制中发挥重要的作用，调节Pim-3的表达有可能达到治疗颅脑损伤的目的。
[参考文献]
[1] 马冉冉，李光勤，王进平，等. 电针对脑缺血再灌注后大鼠脑缺血区生长相关蛋白-43与神经蛋白聚糖表达的影响[J].中国老年学杂志，2009，19（14）：2675-2678.
[2] Hoh NZ,Wagner AK,Alexander SA,et al. BCL2 genotypes: functional and neurobehavioral outcomes after severe traumatic brain injury[J].J Neurotrauma,2010,27(8):1413-1427.
[3] Park OH,Lee KJ,Rhyu IJ,et al.Bax-dependent and -independent death of motoneurons after facial nerve injury in adult mice[J].Eur J Neurosci,2007,26(6):1421-1432.
[4] Tehranian R,Rose ME,Vagni V,et al.Disruption of Bax protein prevents neuronal cell death but produces cognitive impairment in mice following traumatic brain injury[J].J Neurotrauma,2008,25(7):755-767.
[5] Satchell MA,Lai Y,Kochanek PM,et al.Cytochrome c, a biomarker of apoptosis, is increased in cerebrospinal fluid from infants with inflicted brain injury from child abuse[J].J Cereb Blood Flow Metab, 2005,25(7):919-927.
[6] Li LZ,Bao YJ,Zhao M.17beta-estradiol attenuates programmed cell death in cortical pericontusional zone following traumatic brain injury via upregulation of ERalpha and inhibition of caspase-3 activation[J]. Neurochem Int,2011,58(1):126-133.
[7] Zhang X,Graham SH,Kochanek PM.Caspase-8 expression andproteolysis in human brain after severe head injury[J].FASEB J,2008,17(10):1367-1369.
[8] Brault L,Gasser C,Bracher F,et al.PIM serine/threonine kinases in the pathogenesis and therapy of hematologic m alignancies and solid cancers[J].Haematologica,2010,95(6):1004-1015.
[9] Liu D,He M,Yi B,et al.Pim-3 protects against cardiomyocyte apoptosis in anoxia/reoxygenation injury via p38-mediated signal pathway[J].Int J Biochem Cell Biol,2009,41(11):2315-22.
[10] Yang H,Wang Y,Qian H,et al.Pim protein kinase-3 is regulated by TNF-α and promotes endothelial cell sprouting[J].Mol Cells,2011,32(3):235-241.
（收稿日期：2011-10-20）