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摘要
为获得对水稻纹枯病有生防效果的拮抗放线菌，以水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）为指示菌，从湖南郴州天鹅山风景区土样中分离筛选出5株拮抗放线菌株，其中菌株CZB40无菌滤液的5倍稀释液对指示菌菌丝生长抑制率高达90.45%，能使菌核菌丝萌发指数降低56.30%，而且能显著抑制菌核的形成。经形态观察、培养性状、生理生化鉴定，并结合16S rDNA 序列分析，将CZB40菌株鉴定为极暗黄链霉菌（Streptomyces fulvissimus）。抗菌谱研究表明，该菌株对稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）、桃褐腐病菌（Monilinia fructicola）、辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）、草莓灰霉病菌（Botrytis cinerea）和辣椒白绢病菌（Sclerotium rolfsii）都有拮抗作用，抑菌率达27.94%～85.71%。通过单因子变量法和均匀设计法对菌株CZB40进行发酵条件研究。结果表明，其最佳的发酵条件为： 玉米粉 25 g/L、酵母粉 5 g/L、MgSO4 0.2 g/L、NaCl 0.8 g/L、K2HPO4 0.4 g、水 1 000 mL、29 ℃、pH 6.0。经优化后，菌株CZB40无菌滤液的10倍稀释液对水稻纹枯菌丝生长抑制率最高，达到94.85%，比优化前明显提高。该研究结果为水稻纹枯病的生物防治提供科学依据。
关键词
水稻纹枯病；放线菌；生物防治；发酵条件
中图分类号：
S 482.292
文献标识码：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2015.05.008
Abstract
To obtain antagonistic actinomycetes for biocontrol of rice sheath blight， five antagonistic actinomycetes strains were isolated from soil samples in Chenzhou Swan Mountain of Hunan Province. Among these samples， the 5× diluted sterile filtrate of CZB40 strain exhibited the highest antagonistic activity， showing 90.45% mycelial growth inhibition and leading to decrease of mycelial germination index by 56.30%. In addition， the formation of sclerotia could be significantly inhibited. By studying the morphology， culture characteristics， physiological， biochemical tests and 16S rDNA analysis， CZB40 was identified as Streptomyces fulvissimus. Further antimicrobial spectrum research demonstrated that the strain CZB40 had antagonism against Magnaporthe grisea， Monilinia fructicola， Phytophthora capsici， Botrytis cinerea and Sclerotium rolfsii， with the inhibition rate from 27.94% to 85.71%.The fermentation conditions were optimized by using the method of one variable and uniform design. The optional fermentation conditions for antibacterial substance production of CZB40 were shown as followed： corn flour 25 g， yeast 5 g， MgSO4 0.2 g， NaCl 0.8 g， K2HPO40.4 g， water 1 000 mL， fermentation temperature 29 ℃ and pH 6. After optimization， the mycelial growth inhibition rate increased significantly up to 94.85% with 10 times sterile filtrate compared with previous fermentation conditions. The results provided scientific evidence in biocontrol of rice sheath blight.
Key words
rice sheath blight；actinomycetes；biological control；fermentation condition
水稻纹枯病是由立枯丝核菌（Rhizoctonia solani ）引起的导致水稻减产的重要病害[1]，一般可减产10%～30%，发病严重时可达50%。近年来，随着高产杂交稻品种的推广，施氮水平的提高，水稻复种指数的上升，纹枯病的发生日趋严重。目前我国水稻纹枯病的防治主要以井冈霉素为主，然而长期单一使用井冈霉素易导致R.solani产生抗药性[2]。而化学药剂的使用易带来农药残留、环境污染等问题，这些问题已引起国内外有关专家的高度关注。因此，加快新型农药品种研制和采用拮抗微生物来防治水稻纹枯病非常必要。 目前，国内外已报道了多种真菌、细菌和放线菌等微生物对水稻纹枯病具有不同程度防治效果[38]。Choi等[9]分离得到两株荧光假单孢杆菌（Pseudomonas fluorescens）mc75和pc78，两者互作能抑制纹枯病菌肽的生产和生物膜的形成。Wan等[10]报道，链霉菌（Streptomyces platensis）F1对水稻纹枯病有很好的抑制作用。Rabindran等[11]分离了4 株对水稻纹枯病有抑制作用的荧光假单胞菌，其中PfALR2的防治效果最好。王兰英等[12]从砂仁中分离的4株内生细菌对水稻纹枯病有较好的抑菌活性，其中SRJ24抑菌效果最好，抑菌带宽度达到18 mm，与其他菌株相比达极显著水平。朱晓飞等[13]分离筛选到对水稻纹枯病菌有强拮抗作用的解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens） YB3，具有广谱高效的植物病原菌拮抗活性。崔宇辉等[14]从采自浙江金华市各地的68份土样中分离筛选到吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）Sh43对水稻纹枯病菌具有较强的拮抗作用，其抑菌带宽度为28.3 mm。曹琦琦等[15]从不同土壤、植物和纹枯病菌菌核样品中分离筛选到对水稻纹枯病菌具有较强拮抗活性的细菌和放线菌菌株各1株，菌丝生长抑制率分别为75.56%和84.07%。
本试验从湖南省郴州市天鹅山风景区采集的土样中筛选出一株对水稻纹枯病菌有拮抗活性的放线菌CZB40菌株，能显著抑制纹枯病菌的菌核形成。结合形态、培养特征以及16S rDNA序列对其进行了分类鉴定，另外对其发酵条件及发酵液的性质进行了研究，旨在为进一步防治水稻纹枯病提供生防材料。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1土壤样品
土壤样品采集于湖南省郴州市天鹅山风景区，于室温下风干，待分离。
1.1.2供试菌株
本研究所涉及的病原菌均为本实验室分离、鉴定和保存，分别为水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）、草莓灰霉病菌（Botrytis cinerea）、稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）、辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）、辣椒白绢病菌（Sclerotium rolfsii）、桃褐腐病菌（Monilinia fructicola）。
1.1.3供试培养基及试剂
发酵初始培养基配方为：可溶性淀粉20 g、蛋白胨 3 g、K2HPO4 0.5 g、NaCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.5 g、蒸馏水1 000 mL，pH 7.2。拮抗试验培养基为马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基。所用试剂均由长沙鹏润生物公司提供的市售生化试剂（分析纯）。
1.2土壤放线菌的分离、保存
采用稀释涂布平板法[16]进行放线菌的分离。将采集的土壤稀释成不同浓度的土壤稀释液，分别滴加到含有3‰抑菌剂（K2Cr2O7）的高氏1号培养基平板上，用无菌涂布棒涂匀，静置30 min后，将培养皿放在28 ℃温箱中倒置培养。采用画线法纯化菌株，所得菌株斜面保存，备用。
1.3水稻纹枯病拮抗菌的筛选及测定
按照朱宏建等[17]的方法进行拮抗放线菌的筛选及测定。用细菌过滤器过滤发酵液。采用含毒介质法进行拮抗测定，每皿中加入菌株过滤液原液3 mL，倒入12 mL PDA 培养基（55 ℃左右） 混匀，制成平板，待冷却后，每皿中央接种水稻纹枯病菌菌饼（直径5 mm），设清水对照，每个处理重复3 次。静置1 h 后放入28 ℃恒温箱中培养，待对照菌落长满整个平板，用十字交叉法测量菌落直径，记录结果并按下式计算抑制率：
抑制率（%） =（对照菌落直径-处理菌落直径）/
（对照菌落直径-菌饼直径）×100。
1.4拮抗菌株对纹枯病菌菌核形成及萌发的影响
将生长状况一致，直径为5 mm的纹枯病菌菌饼置于经细菌过滤器过滤后的发酵液与PDA混合的培养基上，置于28 ℃培养，记录菌核形成的时间及菌核数目。
拮抗菌株对纹枯病菌菌核萌发的影响按照郑爱萍等[18]的方法进行。将灭菌的载玻片浸入融化的PDA琼脂中，使之附上一层琼脂，取出放在培养皿内，每皿1片，皿内加5 mL无菌水保湿。选取大小、形成时间一致的菌核置于发酵菌液中（浓度稀释为108 cfu/mL）处理10 s，然后放在附有琼脂的载玻片上，每片3粒，粒距1.5 cm，每处理8片24粒，置于28 ℃培养箱中培养，24 h后镜检菌核的萌发情况。菌丝的萌发指数测定[19]：在玻片背面距菌核边缘2 mm处画一圈，低倍镜下观察，以菌丝长出圈外者定为萌发菌丝。萌发菌丝按以下标准分级：0—萌发菌丝数为0；1—萌发菌丝数为1～20；2—萌发菌丝数为21～50；3—萌发菌丝数为51～80；4—萌发菌丝数为81～140；5—萌发菌丝数在140以上。再按以下公式计算菌丝萌发指数：
菌丝萌发指数（%）=
∑（各级级值×该级菌核数）调查总菌核数×5×100。
1.5拮抗菌株CZB40的分类鉴定
1.5.1拮抗菌株CZB40形态观察和生理生化特性
形态观察及生理生化测定方法均按照阮继生和Kauffmann 等[2021]的方法进行。
1.5.2拮抗菌株的分子生物学鉴定
1.5.2.1放线菌株DNA 的提取与PCR扩增
参照Kauffmann等[22]及Nikodinovic等[23]的方法提取放线菌基因组DNA，并采用通用引物1492R（5′GGTTACCTTGTTACGACTT3′）和27F（5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′）进行PCR扩增，PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃复性30 s，72 ℃延伸90 s，33个循环；72 ℃延伸10 min。用1.0%的琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳检测。采用北京天根生化科技有限公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段，并采用该公司的pGMT克隆试剂盒进行PCR扩增产物的连接以及连接产物的转化。挑选阳性克隆送上海生工生物工程技术有限公司测序。 1.5.2.2系统发育分析
将测定的16S rDNA序列提交到GenBank数据库，用BLAST软件与GenBank中已知的16S rDNA序列进行同源性比较，选取属内同源性较高的放线菌16S rDNA序列，用MEGA 4.0软件进行系统发育分析，绘制菌株的系统进化树[24]。
1.6拮抗菌CZB40的抗菌谱测定
操作方法同1.3。
1.7发酵条件的优化
1.7.1碳、氮源的优化
采用单因子变量法，分别以大米粉、蔗糖、马铃薯淀粉、玉米粉、麦芽糖、葡萄糖代替对照培养基中的碳源（可溶性淀粉），进行碳源的优化；分别以酵母粉、硝酸钾、大豆粉、硝酸钠、硫酸铵代替对照培养基中的氮源（蛋白胨），进行氮源优化。刮取1.3中筛选到的菌株的孢子接入三角瓶（300 mL容量）的100 mL液体种子培养基中，28 ℃，200 r/min振荡培养48 h；液体种子以5%的接种量接入含100 mL各种培养基中的三角瓶中（300 mL容量），28 ℃，200 r/min发酵培养72 h。按照1.3中的方法，测定各个处理的抑菌效果。
1.7.2均匀设计法优化发酵条件
用获得的最优碳、氮源代替对照培养基中的碳、氮源作为发酵培养基，并将碳源、氮源、NaCl、MgSO4、K2HPO4、pH、温度作为影响发酵条件的7个因素，每个因素分别按一定浓度梯度设置5个水平，设计U20 （57）的均匀设计表。按照1.3中的方法，将各个处理的发酵液稀释5倍，进行抑菌效果测定。
1.8发酵液稳定性的测定
1.8.1紫外照射稳定性测定
取CZB40菌株发酵液100 mL置于无菌培养皿中，在距20 W紫外灯10 cm处，分别照射1、3、5、7、9、12 h，然后用含毒介质法测定其抑菌活性，并以未处理的发酵液为对照。
1.8.2pH稳定性测定
将菌株发酵液用1 mol/L的NaOH和1 mol/L的HCl分别调至pH为 4、5、6、7、8、9、10，静置2 h后将其分别调回自然pH（pH=7.3），测定抑菌活性，并以未处理的发酵液为对照。
1.8.3热稳定性测定
将等体积的菌株发酵液分别在50、60、70、80、90、100 ℃下处理1 h，室温冷却，未经处理的发酵液作为对照，测定抑菌活性。
2结果与分析
2.1放线菌的分离筛选及拮抗活性测定
从郴州市天鹅山自然风景区采集的18份土壤中筛选得到217个放线菌菌落，以水稻纹枯病菌为指示菌，筛选出5株具有拮抗作用的菌株，其中以CZB40菌株的抑菌效果最好（图1），该菌株的5倍无菌发酵滤液对指示菌的菌丝生长抑制效果也十分显著（图2）其抑制率高达90.45%。
2.2CZB40菌株对水稻纹枯菌菌核形成及萌发的影响
按1.4小节方法处理后，菌核的菌丝萌发指数降低了56.30%，菌核形成时间延长了36 h，平均每皿形成的菌核数仅为2粒，而以清水为对照处理的每皿形成的菌核数为17粒（表1）。
2.3放线菌CZB40菌株的分类鉴定
2.3.1CZB40菌株的形态特征
CZB40菌株在高氏1号培养基上生长，菌落紧密，基内菌丝深红褐色，后期深橙色至红褐色，可溶色素褐黄色。气生菌丝很丰富，在扫描电镜下观察发现，气生菌丝体形成孢子链时，孢子丝直、柔曲，孢子呈长圆柱形，表面光滑（图3）。
2.3.2CZB40菌株的分子生物学鉴定
PCR扩增及上海生工生物工程有限公司测序及拼接结果显示，CZB40菌株的16S rDNA扩增产物的大小为1 474 bp。将菌株的16S rDNA序列提交至GenBank中（KJ751551），并用BLAST软件与GenBank中已公开的16S rDNA序列进行同源性比较，计算所测定的CZB40菌株的16S rDNA全序列遗传距离，并根据遗传距离用MEGA 4.0软件构建系统发育树（图4）。结果表明，CZB40菌株与极暗黄链霉菌（S.fulvissimus）的16S rDNA序列相似性达到99%。
2.3.3生理生化特性
CZB40菌株在高氏1号固体培养基中生长产生褐黄色色素。菌株能分解利用纤维素，使明胶液化，能水解淀粉，能产生硫化氢，能使牛奶胨化，但不能使牛奶凝固。根据生理生化特征分析，再结合形态学与培养特征及分子生物学鉴定结果，将其鉴定为极暗黄链霉菌（S.fulvissimus）。
2.4菌株CZB40抗菌谱测定结果
抗菌谱测定结果表明，该菌株的发酵滤液对供试的多种植物病原菌均有抑制作用，菌丝生长抑制率为27.94%～85.71%（表2）。其中，对桃褐腐病菌的抑菌效果较好，抑制率达到85.71%。在5%和1%水平上显著高于其他几种病原菌。
2.5发酵条件优化结果
2.5.1不同碳、氮源对菌株发酵液抑菌活性的影响
在供试的6种碳源和5种氮源中，最优的碳源是玉米粉，对指示菌的生长抑制率为91.76%，最优的氮源是酵母粉，抑制率为92.50%（表3）。所以，选择玉米粉和酵母粉作为最优的碳源、氮源进行发酵条件研究。
2.5.2均匀设计试验优化发酵条件
选择最优碳源（玉米粉）、最优氮源（酵母粉）、NaCl、MgSO4、K2HPO4、pH、温度为影响发酵条件的7个因素，每个因素设置5个水平，共20个处理，设计U20 （57）的均匀设计表。将菌株CZB40按表中设计的20种发酵条件进行发酵，试验结果用DPS数据库处理系统进行分析和统计，得到各个发酵条件下的滤液对水稻纹枯病菌的抑制效果，在滤液稀释10倍时对菌丝生长抑制率最高达到94.85%，比优化前明显提高（表4）。从表中可知，该菌株的最优发酵条件是玉米粉25 g/L、酵母粉5 g/L、MgSO4 0.2 g/L、NaCl 0.8 g/L、K2HPO4 0.4 g/L、水1 000 mL、29 ℃、pH 6.0。 2.6抑菌活性成分的特性分析
2.6.1紫外稳定性
菌株发酵液距20 W紫外灯10 cm照射1、3、5、7、9、12 h后，与原发酵液相比较，对水稻纹枯病菌的抑制率变化不大，说明菌株CZB40发酵液对紫外线不敏感。
2.6.2酸碱稳定性
放线菌菌株CZB40发酵液在酸性和碱性条件下比较敏感，稳定性差。分别用1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH调原发酵液pH至4.0和10.0，处理2 h后，调回至原发酵液的pH，对水稻纹枯病菌的抑制率为53.80%和52.58%，与原发酵液90.45%相比，下降明显（图5）。因此在发酵液活性物质分离纯化和使用过程中应尽量保持pH 6～7的条件。
2.6.3热稳定性
放线菌菌株CZB40发酵液热稳定性较好。与原发酵液相比，在50 ℃以下处理1 h后，抑制率没有变化。随着温度的升高，对水稻纹枯病菌的抑制率开始出现下降，在100 ℃处理1 h后，抑制率为68.78%，与原发酵液90.45%相比，仅下降了21.67%（图6），说明菌株CZB40发酵液能耐高温。
3讨论
目前研究者普遍认为：菌核在水稻纹枯病的传播中起重要作用，但目前报道的生防菌作用机制都是基于抑制病原菌菌丝生长为靶标的，抑制菌核形成的生防放线菌鲜有报道。郑爱萍等[18]曾报道过致黄假单胞菌对水稻纹枯病菌菌核形成具有明显抑制作用，并能使菌核的菌丝萌发率降低69.0%。张慧雯等[25]曾报道链霉菌702所产生的抗真菌活性物质，对水稻纹枯病菌的EC50为1.128 05 mg/L，且对菌核萌发有较强的抑制作用。因此，筛选抑制纹枯病菌菌核形成及萌发的生防菌在生产上更有应用价值。本研究筛选到的生防放线菌菌株CZB40对纹枯病菌菌丝生长抑制率高达90.45%，并且能使菌核的菌丝萌发指数降低56.30%，显著抑制菌核的形成。
链霉菌产生的抗菌活性物质多为次级代谢产物，其生产效率不仅与菌种自身的性能相关，而且还要有最优的发酵条件。本研究对放线菌菌株CZB40需要的碳源、氮源进行了筛选，在此基础上对其发酵条件，如温度、pH、NaCl、MgSO4、K2HPO4等，进行均匀设计优化。另外对菌株CZB40发酵液性质进行了初步研究，这些研究结果为该菌株抗菌化合物的分离纯化、结构鉴定和拮抗机理的研究奠定了基础。
极暗黄链霉菌（S.fulvissimus）是一种能产生重要活性物质的放线菌，已经有大量研究人员对其代谢产物进行了报道。Malik 等[26]发现S.fulvissimus分泌抗菌蛋白，该蛋白表现出对金黄葡萄球菌（Staphylococcus aureus） MRSA菌株有显著抑菌作用。它可能成为用于控制耐药性革兰氏阳性细菌新药物的重要来源。Ohbuchi等[27]报道S.fulvissimus产生溶解酶制剂，表现出N乙酰氨基葡萄糖苷酶和溶菌酶活性，可以迅速裂解细菌细胞。
本研究是国内首次报道使用极暗黄链霉菌（S.fulvissimus）拮抗水稻纹枯病菌。获得的菌株CZB40具有较高的杀菌活性和稳定性，可能是一种高效的新型生物农药的出发菌株，具有良好的开发前景，进一步的研究可从宏观方面对菌株CZB40发酵液中抗菌活性物质进行分离纯化、结构鉴定，并通过小区试验、田间试验检验其生防效果，进一步开发为生物农药；从微观方面可应用分子生物学手段研究其拮抗物质生物合成的功能基因及合成机理，并通过对野生菌株进行改良，使之符合生防要求。目前，本课题组已经开始分离纯化菌株CZB40发酵液中抗菌活性物质的主要成分。
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（责任编辑：田喆）
为获得对水稻纹枯病有生防效果的拮抗放线菌，以水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）为指示菌，从湖南郴州天鹅山风景区土样中分离筛选出5株拮抗放线菌株，其中菌株CZB40无菌滤液的5倍稀释液对指示菌菌丝生长抑制率高达90.45%，能使菌核菌丝萌发指数降低56.30%，而且能显著抑制菌核的形成。经形态观察、培养性状、生理生化鉴定，并结合16S rDNA 序列分析，将CZB40菌株鉴定为极暗黄链霉菌（Streptomyces fulvissimus）。抗菌谱研究表明，该菌株对稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）、桃褐腐病菌（Monilinia fructicola）、辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）、草莓灰霉病菌（Botrytis cinerea）和辣椒白绢病菌（Sclerotium rolfsii）都有拮抗作用，抑菌率达27.94%～85.71%。通过单因子变量法和均匀设计法对菌株CZB40进行发酵条件研究。结果表明，其最佳的发酵条件为： 玉米粉 25 g/L、酵母粉 5 g/L、MgSO4 0.2 g/L、NaCl 0.8 g/L、K2HPO4 0.4 g、水 1 000 mL、29 ℃、pH 6.0。经优化后，菌株CZB40无菌滤液的10倍稀释液对水稻纹枯菌丝生长抑制率最高，达到94.85%，比优化前明显提高。该研究结果为水稻纹枯病的生物防治提供科学依据。
关键词
水稻纹枯病；放线菌；生物防治；发酵条件
中图分类号：
S 482.292
文献标识码：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2015.05.008
Abstract
To obtain antagonistic actinomycetes for biocontrol of rice sheath blight， five antagonistic actinomycetes strains were isolated from soil samples in Chenzhou Swan Mountain of Hunan Province. Among these samples， the 5× diluted sterile filtrate of CZB40 strain exhibited the highest antagonistic activity， showing 90.45% mycelial growth inhibition and leading to decrease of mycelial germination index by 56.30%. In addition， the formation of sclerotia could be significantly inhibited. By studying the morphology， culture characteristics， physiological， biochemical tests and 16S rDNA analysis， CZB40 was identified as Streptomyces fulvissimus. Further antimicrobial spectrum research demonstrated that the strain CZB40 had antagonism against Magnaporthe grisea， Monilinia fructicola， Phytophthora capsici， Botrytis cinerea and Sclerotium rolfsii， with the inhibition rate from 27.94% to 85.71%.The fermentation conditions were optimized by using the method of one variable and uniform design. The optional fermentation conditions for antibacterial substance production of CZB40 were shown as followed： corn flour 25 g， yeast 5 g， MgSO4 0.2 g， NaCl 0.8 g， K2HPO40.4 g， water 1 000 mL， fermentation temperature 29 ℃ and pH 6. After optimization， the mycelial growth inhibition rate increased significantly up to 94.85% with 10 times sterile filtrate compared with previous fermentation conditions. The results provided scientific evidence in biocontrol of rice sheath blight.
Key words
rice sheath blight；actinomycetes；biological control；fermentation condition
水稻纹枯病是由立枯丝核菌（Rhizoctonia solani ）引起的导致水稻减产的重要病害[1]，一般可减产10%～30%，发病严重时可达50%。近年来，随着高产杂交稻品种的推广，施氮水平的提高，水稻复种指数的上升，纹枯病的发生日趋严重。目前我国水稻纹枯病的防治主要以井冈霉素为主，然而长期单一使用井冈霉素易导致R.solani产生抗药性[2]。而化学药剂的使用易带来农药残留、环境污染等问题，这些问题已引起国内外有关专家的高度关注。因此，加快新型农药品种研制和采用拮抗微生物来防治水稻纹枯病非常必要。 目前，国内外已报道了多种真菌、细菌和放线菌等微生物对水稻纹枯病具有不同程度防治效果[38]。Choi等[9]分离得到两株荧光假单孢杆菌（Pseudomonas fluorescens）mc75和pc78，两者互作能抑制纹枯病菌肽的生产和生物膜的形成。Wan等[10]报道，链霉菌（Streptomyces platensis）F1对水稻纹枯病有很好的抑制作用。Rabindran等[11]分离了4 株对水稻纹枯病有抑制作用的荧光假单胞菌，其中PfALR2的防治效果最好。王兰英等[12]从砂仁中分离的4株内生细菌对水稻纹枯病有较好的抑菌活性，其中SRJ24抑菌效果最好，抑菌带宽度达到18 mm，与其他菌株相比达极显著水平。朱晓飞等[13]分离筛选到对水稻纹枯病菌有强拮抗作用的解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens） YB3，具有广谱高效的植物病原菌拮抗活性。崔宇辉等[14]从采自浙江金华市各地的68份土样中分离筛选到吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）Sh43对水稻纹枯病菌具有较强的拮抗作用，其抑菌带宽度为28.3 mm。曹琦琦等[15]从不同土壤、植物和纹枯病菌菌核样品中分离筛选到对水稻纹枯病菌具有较强拮抗活性的细菌和放线菌菌株各1株，菌丝生长抑制率分别为75.56%和84.07%。
本试验从湖南省郴州市天鹅山风景区采集的土样中筛选出一株对水稻纹枯病菌有拮抗活性的放线菌CZB40菌株，能显著抑制纹枯病菌的菌核形成。结合形态、培养特征以及16S rDNA序列对其进行了分类鉴定，另外对其发酵条件及发酵液的性质进行了研究，旨在为进一步防治水稻纹枯病提供生防材料。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1土壤样品
土壤样品采集于湖南省郴州市天鹅山风景区，于室温下风干，待分离。
1.1.2供试菌株
本研究所涉及的病原菌均为本实验室分离、鉴定和保存，分别为水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）、草莓灰霉病菌（Botrytis cinerea）、稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）、辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）、辣椒白绢病菌（Sclerotium rolfsii）、桃褐腐病菌（Monilinia fructicola）。
1.1.3供试培养基及试剂
发酵初始培养基配方为：可溶性淀粉20 g、蛋白胨 3 g、K2HPO4 0.5 g、NaCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.5 g、蒸馏水1 000 mL，pH 7.2。拮抗试验培养基为马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基。所用试剂均由长沙鹏润生物公司提供的市售生化试剂（分析纯）。
1.2土壤放线菌的分离、保存
采用稀释涂布平板法[16]进行放线菌的分离。将采集的土壤稀释成不同浓度的土壤稀释液，分别滴加到含有3‰抑菌剂（K2Cr2O7）的高氏1号培养基平板上，用无菌涂布棒涂匀，静置30 min后，将培养皿放在28 ℃温箱中倒置培养。采用画线法纯化菌株，所得菌株斜面保存，备用。
1.3水稻纹枯病拮抗菌的筛选及测定
按照朱宏建等[17]的方法进行拮抗放线菌的筛选及测定。用细菌过滤器过滤发酵液。采用含毒介质法进行拮抗测定，每皿中加入菌株过滤液原液3 mL，倒入12 mL PDA 培养基（55 ℃左右） 混匀，制成平板，待冷却后，每皿中央接种水稻纹枯病菌菌饼（直径5 mm），设清水对照，每个处理重复3 次。静置1 h 后放入28 ℃恒温箱中培养，待对照菌落长满整个平板，用十字交叉法测量菌落直径，记录结果并按下式计算抑制率：
抑制率（%） =（对照菌落直径-处理菌落直径）/
（对照菌落直径-菌饼直径）×100。
1.4拮抗菌株对纹枯病菌菌核形成及萌发的影响
将生长状况一致，直径为5 mm的纹枯病菌菌饼置于经细菌过滤器过滤后的发酵液与PDA混合的培养基上，置于28 ℃培养，记录菌核形成的时间及菌核数目。
拮抗菌株对纹枯病菌菌核萌发的影响按照郑爱萍等[18]的方法进行。将灭菌的载玻片浸入融化的PDA琼脂中，使之附上一层琼脂，取出放在培养皿内，每皿1片，皿内加5 mL无菌水保湿。选取大小、形成时间一致的菌核置于发酵菌液中（浓度稀释为108 cfu/mL）处理10 s，然后放在附有琼脂的载玻片上，每片3粒，粒距1.5 cm，每处理8片24粒，置于28 ℃培养箱中培养，24 h后镜检菌核的萌发情况。菌丝的萌发指数测定[19]：在玻片背面距菌核边缘2 mm处画一圈，低倍镜下观察，以菌丝长出圈外者定为萌发菌丝。萌发菌丝按以下标准分级：0—萌发菌丝数为0；1—萌发菌丝数为1～20；2—萌发菌丝数为21～50；3—萌发菌丝数为51～80；4—萌发菌丝数为81～140；5—萌发菌丝数在140以上。再按以下公式计算菌丝萌发指数：
菌丝萌发指数（%）=
∑（各级级值×该级菌核数）调查总菌核数×5×100。
1.5拮抗菌株CZB40的分类鉴定
1.5.1拮抗菌株CZB40形态观察和生理生化特性
形态观察及生理生化测定方法均按照阮继生和Kauffmann 等[2021]的方法进行。
1.5.2拮抗菌株的分子生物学鉴定
1.5.2.1放线菌株DNA 的提取与PCR扩增
参照Kauffmann等[22]及Nikodinovic等[23]的方法提取放线菌基因组DNA，并采用通用引物1492R（5′GGTTACCTTGTTACGACTT3′）和27F（5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′）进行PCR扩增，PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃复性30 s，72 ℃延伸90 s，33个循环；72 ℃延伸10 min。用1.0%的琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳检测。采用北京天根生化科技有限公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段，并采用该公司的pGMT克隆试剂盒进行PCR扩增产物的连接以及连接产物的转化。挑选阳性克隆送上海生工生物工程技术有限公司测序。 1.5.2.2系统发育分析
将测定的16S rDNA序列提交到GenBank数据库，用BLAST软件与GenBank中已知的16S rDNA序列进行同源性比较，选取属内同源性较高的放线菌16S rDNA序列，用MEGA 4.0软件进行系统发育分析，绘制菌株的系统进化树[24]。
1.6拮抗菌CZB40的抗菌谱测定
操作方法同1.3。
1.7发酵条件的优化
1.7.1碳、氮源的优化
采用单因子变量法，分别以大米粉、蔗糖、马铃薯淀粉、玉米粉、麦芽糖、葡萄糖代替对照培养基中的碳源（可溶性淀粉），进行碳源的优化；分别以酵母粉、硝酸钾、大豆粉、硝酸钠、硫酸铵代替对照培养基中的氮源（蛋白胨），进行氮源优化。刮取1.3中筛选到的菌株的孢子接入三角瓶（300 mL容量）的100 mL液体种子培养基中，28 ℃，200 r/min振荡培养48 h；液体种子以5%的接种量接入含100 mL各种培养基中的三角瓶中（300 mL容量），28 ℃，200 r/min发酵培养72 h。按照1.3中的方法，测定各个处理的抑菌效果。
1.7.2均匀设计法优化发酵条件
用获得的最优碳、氮源代替对照培养基中的碳、氮源作为发酵培养基，并将碳源、氮源、NaCl、MgSO4、K2HPO4、pH、温度作为影响发酵条件的7个因素，每个因素分别按一定浓度梯度设置5个水平，设计U20 （57）的均匀设计表。按照1.3中的方法，将各个处理的发酵液稀释5倍，进行抑菌效果测定。
1.8发酵液稳定性的测定
1.8.1紫外照射稳定性测定
取CZB40菌株发酵液100 mL置于无菌培养皿中，在距20 W紫外灯10 cm处，分别照射1、3、5、7、9、12 h，然后用含毒介质法测定其抑菌活性，并以未处理的发酵液为对照。
1.8.2pH稳定性测定
将菌株发酵液用1 mol/L的NaOH和1 mol/L的HCl分别调至pH为 4、5、6、7、8、9、10，静置2 h后将其分别调回自然pH（pH=7.3），测定抑菌活性，并以未处理的发酵液为对照。
1.8.3热稳定性测定
将等体积的菌株发酵液分别在50、60、70、80、90、100 ℃下处理1 h，室温冷却，未经处理的发酵液作为对照，测定抑菌活性。
2结果与分析
2.1放线菌的分离筛选及拮抗活性测定
从郴州市天鹅山自然风景区采集的18份土壤中筛选得到217个放线菌菌落，以水稻纹枯病菌为指示菌，筛选出5株具有拮抗作用的菌株，其中以CZB40菌株的抑菌效果最好（图1），该菌株的5倍无菌发酵滤液对指示菌的菌丝生长抑制效果也十分显著（图2）其抑制率高达90.45%。
2.2CZB40菌株对水稻纹枯菌菌核形成及萌发的影响
按1.4小节方法处理后，菌核的菌丝萌发指数降低了56.30%，菌核形成时间延长了36 h，平均每皿形成的菌核数仅为2粒，而以清水为对照处理的每皿形成的菌核数为17粒（表1）。
2.3放线菌CZB40菌株的分类鉴定
2.3.1CZB40菌株的形态特征
CZB40菌株在高氏1号培养基上生长，菌落紧密，基内菌丝深红褐色，后期深橙色至红褐色，可溶色素褐黄色。气生菌丝很丰富，在扫描电镜下观察发现，气生菌丝体形成孢子链时，孢子丝直、柔曲，孢子呈长圆柱形，表面光滑（图3）。
2.3.2CZB40菌株的分子生物学鉴定
PCR扩增及上海生工生物工程有限公司测序及拼接结果显示，CZB40菌株的16S rDNA扩增产物的大小为1 474 bp。将菌株的16S rDNA序列提交至GenBank中（KJ751551），并用BLAST软件与GenBank中已公开的16S rDNA序列进行同源性比较，计算所测定的CZB40菌株的16S rDNA全序列遗传距离，并根据遗传距离用MEGA 4.0软件构建系统发育树（图4）。结果表明，CZB40菌株与极暗黄链霉菌（S.fulvissimus）的16S rDNA序列相似性达到99%。
2.3.3生理生化特性
CZB40菌株在高氏1号固体培养基中生长产生褐黄色色素。菌株能分解利用纤维素，使明胶液化，能水解淀粉，能产生硫化氢，能使牛奶胨化，但不能使牛奶凝固。根据生理生化特征分析，再结合形态学与培养特征及分子生物学鉴定结果，将其鉴定为极暗黄链霉菌（S.fulvissimus）。
2.4菌株CZB40抗菌谱测定结果
抗菌谱测定结果表明，该菌株的发酵滤液对供试的多种植物病原菌均有抑制作用，菌丝生长抑制率为27.94%～85.71%（表2）。其中，对桃褐腐病菌的抑菌效果较好，抑制率达到85.71%。在5%和1%水平上显著高于其他几种病原菌。
2.5发酵条件优化结果
2.5.1不同碳、氮源对菌株发酵液抑菌活性的影响
在供试的6种碳源和5种氮源中，最优的碳源是玉米粉，对指示菌的生长抑制率为91.76%，最优的氮源是酵母粉，抑制率为92.50%（表3）。所以，选择玉米粉和酵母粉作为最优的碳源、氮源进行发酵条件研究。
2.5.2均匀设计试验优化发酵条件
选择最优碳源（玉米粉）、最优氮源（酵母粉）、NaCl、MgSO4、K2HPO4、pH、温度为影响发酵条件的7个因素，每个因素设置5个水平，共20个处理，设计U20 （57）的均匀设计表。将菌株CZB40按表中设计的20种发酵条件进行发酵，试验结果用DPS数据库处理系统进行分析和统计，得到各个发酵条件下的滤液对水稻纹枯病菌的抑制效果，在滤液稀释10倍时对菌丝生长抑制率最高达到94.85%，比优化前明显提高（表4）。从表中可知，该菌株的最优发酵条件是玉米粉25 g/L、酵母粉5 g/L、MgSO4 0.2 g/L、NaCl 0.8 g/L、K2HPO4 0.4 g/L、水1 000 mL、29 ℃、pH 6.0。 2.6抑菌活性成分的特性分析
2.6.1紫外稳定性
菌株发酵液距20 W紫外灯10 cm照射1、3、5、7、9、12 h后，与原发酵液相比较，对水稻纹枯病菌的抑制率变化不大，说明菌株CZB40发酵液对紫外线不敏感。
2.6.2酸碱稳定性
放线菌菌株CZB40发酵液在酸性和碱性条件下比较敏感，稳定性差。分别用1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH调原发酵液pH至4.0和10.0，处理2 h后，调回至原发酵液的pH，对水稻纹枯病菌的抑制率为53.80%和52.58%，与原发酵液90.45%相比，下降明显（图5）。因此在发酵液活性物质分离纯化和使用过程中应尽量保持pH 6～7的条件。
2.6.3热稳定性
放线菌菌株CZB40发酵液热稳定性较好。与原发酵液相比，在50 ℃以下处理1 h后，抑制率没有变化。随着温度的升高，对水稻纹枯病菌的抑制率开始出现下降，在100 ℃处理1 h后，抑制率为68.78%，与原发酵液90.45%相比，仅下降了21.67%（图6），说明菌株CZB40发酵液能耐高温。
3讨论
目前研究者普遍认为：菌核在水稻纹枯病的传播中起重要作用，但目前报道的生防菌作用机制都是基于抑制病原菌菌丝生长为靶标的，抑制菌核形成的生防放线菌鲜有报道。郑爱萍等[18]曾报道过致黄假单胞菌对水稻纹枯病菌菌核形成具有明显抑制作用，并能使菌核的菌丝萌发率降低69.0%。张慧雯等[25]曾报道链霉菌702所产生的抗真菌活性物质，对水稻纹枯病菌的EC50为1.128 05 mg/L，且对菌核萌发有较强的抑制作用。因此，筛选抑制纹枯病菌菌核形成及萌发的生防菌在生产上更有应用价值。本研究筛选到的生防放线菌菌株CZB40对纹枯病菌菌丝生长抑制率高达90.45%，并且能使菌核的菌丝萌发指数降低56.30%，显著抑制菌核的形成。
链霉菌产生的抗菌活性物质多为次级代谢产物，其生产效率不仅与菌种自身的性能相关，而且还要有最优的发酵条件。本研究对放线菌菌株CZB40需要的碳源、氮源进行了筛选，在此基础上对其发酵条件，如温度、pH、NaCl、MgSO4、K2HPO4等，进行均匀设计优化。另外对菌株CZB40发酵液性质进行了初步研究，这些研究结果为该菌株抗菌化合物的分离纯化、结构鉴定和拮抗机理的研究奠定了基础。
极暗黄链霉菌（S.fulvissimus）是一种能产生重要活性物质的放线菌，已经有大量研究人员对其代谢产物进行了报道。Malik 等[26]发现S.fulvissimus分泌抗菌蛋白，该蛋白表现出对金黄葡萄球菌（Staphylococcus aureus） MRSA菌株有显著抑菌作用。它可能成为用于控制耐药性革兰氏阳性细菌新药物的重要来源。Ohbuchi等[27]报道S.fulvissimus产生溶解酶制剂，表现出N乙酰氨基葡萄糖苷酶和溶菌酶活性，可以迅速裂解细菌细胞。
本研究是国内首次报道使用极暗黄链霉菌（S.fulvissimus）拮抗水稻纹枯病菌。获得的菌株CZB40具有较高的杀菌活性和稳定性，可能是一种高效的新型生物农药的出发菌株，具有良好的开发前景，进一步的研究可从宏观方面对菌株CZB40发酵液中抗菌活性物质进行分离纯化、结构鉴定，并通过小区试验、田间试验检验其生防效果，进一步开发为生物农药；从微观方面可应用分子生物学手段研究其拮抗物质生物合成的功能基因及合成机理，并通过对野生菌株进行改良，使之符合生防要求。目前，本课题组已经开始分离纯化菌株CZB40发酵液中抗菌活性物质的主要成分。
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（责任编辑：田喆）