【摘 要】
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[目的]构建含绿色荧光蛋白(EGFP)重组人高密度脂蛋白B族Ⅰ型清道夫受体(SR-BI)基因腺相关病毒(rAAV)2/1杂合载体,观察其在HepG2肝细胞的表达.[方法]以pCMV.SPORT6-SR-BI质粒
【机 构】
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中山大学,附属第二医院心血管内科,广东,广州,510120中山大学,附属第五医院心血管内科,广东,珠海,519000;
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[目的]构建含绿色荧光蛋白(EGFP)重组人高密度脂蛋白B族Ⅰ型清道夫受体(SR-BI)基因腺相关病毒(rAAV)2/1杂合载体,观察其在HepG2肝细胞的表达.[方法]以pCMV.SPORT6-SR-BI质粒为模板PCR扩增目的基因cDNA,将其克隆至pSNAV2.0-IRES-EGFP-LacZa载体中,经酶切及测序鉴定后,脂质体介导转染BHK21细胞,经G418筛选得到含SR-BI基因的BHK/SR-BI-IRES-EGFP载体细胞株,用携带rep2-capl基因的辅助病毒(rHsv/r2cl)感染该细胞株.通过细胞孵育、裂解和病毒纯化,得到杂合载体rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP病毒.免疫荧光显微镜检测绿色荧光表达,计算转染效率,Western Blot检测转染后SR-BI蛋白的表达.[结果]酶切鉴定表明pSNAV2.0-SR-BI-IRES-EGFP重组成功,基因测序显示装入pSNAV2.0-IRES-EGFP-LacZa质粒中的SR-BI基因正确;成功构建了rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP病毒载体.转染HepG2肝细胞后免疫荧光显微镜检测最佳MOI值为1×10~5时,以此值转染HepG2肝细胞荧光高效表达:Western Blot检测未转染组及rAAV2/1-IRES-EGFP组HepG2肝细胞均有SR-BI蛋白表达,rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP组SR-BI蛋白表达水平较rAAV2/1-IRES-EGFP组及未转染组显著增加.[结论]成功构建了rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP杂合载体系统,转染后SR-BI蛋白在HepG2肝细胞高效表达,为SR-BI生理学作用机制及临床应用的深入研究奠定基础.
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