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摘要：测量不确定度是评定测量水平的指标，也是判定测量结果的依据，因此正确评定测量不确定度对客观分析测量结果及进行实验室质量管理具有重要意义。而菌落总数是重要的卫生质量指标之一，对食品中菌落总数测定结果进行不确定度评定并确定其置信区间范围具有非常重要的意义，可以有效客观判定产品卫生质量指标是否真正符合标准。本文按GB 4789.2-2010《食品微生物学检验 菌落总数测定》的步骤对食品中菌落总数进行测定，并依据JJF 1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》确认其测定结果的不确定度和置信空间。
关键词：不确定度 食品微生物检测 准确度
中图分类号：TS207.4 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2014）12-0026-02
测量不确定度是为表征合理地赋予被测量之值的分散性，与测量结果相联系的参数[1]。一个完整的测量结果除了给出最佳估计值外，还要对其进行不确定度评定，以确保定量测量的准确度及精密度。目前国内外机构对检测和校准实验室能力或资质进行认证时都非常重视测量不确定度评估，例如《检测和校准实验室能力的通用要求ISO/IEC17025》及CNAS-CL01《检测和校准实验室能力认可准则》 中都明确规定适当时要对测量结果的不确定度进行评定[2]、[3]。
本文通过对实验室自制的20份食品样中的菌落总数进行检测、分析检测结果中不确定度来源、建立数学模型对检测结果进行不确定度评定，为实验室微生物定量检测（包括菌落总数、霉菌及酵母等）的准确度和精密度提供理论依据和实践指导。
1 材料和方法
1.1 检测样品
20份实验室自制的均匀液体食品样。
1.2 检测器材
生化培养箱（36±1℃）、超净工作台、全自动高压蒸汽灭菌器、圆周振荡器、多功能电热鼓风烘箱（46±1℃）、天平（感量0.1g）、刻度移液管（10ml，1ml）。
1.3 培养基和试剂
平板计数琼脂培养基（Merck，按瓶上说明配制，灭菌后备用），无菌生理盐水（0.85%NaCl，灭菌备用）。
1.4 检测方法
依据GB4789.1—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验总则》[4]及GB4789.2—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定方法标准》[5]对食品样中菌落总数进行测定。
1.5 评定方法
依据JJF 1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》确认菌落总数检测结果的不确定度和置信空间。
2 分析不确定度来源及建立测量模型
2.1 测量不确定度来源分析
本次食品样中菌落总数测定的不确定度分量的来源主要有以下几个方面：
（1）重复性引入的不确定度，包括测试环境、培养时间、培养温度、结果修约、样品的均匀性、取样的重复性、人员的计数等；（2）培养条件引入的不确定度，包括培养时间允差、培养温度允差；（3）取样引入的不确定度，包括稀释体积、取样体积；（4）仪器与试剂引入的不确定度，包括所使用的移液管和培养基等；（5）样品保存条件引入的不确定度，包括保存温度和保存时间等。不确定度的来源分析（见图1）。
2.2 测量模型的建立
根据测量原理得到食品样中菌落总数测定数学模型为：
其中，Y为食品样中菌落总数结果（CFU/ml）；X1及X2分别为食品样二次平行检测的菌落总数结果（CFU/ml）。
3 结果与分析
3.1 菌落总数标准不确定度的评定
微生物检验属于非严格性、非度量学和非统计学一类，其特点是同一样品的检测结果相差比较大。因此，相对于化学物资、物理量值等其他类型的定量分析，菌落总数检测中由检测仪器最大容许误差、样品稀释和取样过程等因素引入的不确定度分量（B类不确定度）对合成不确定贡献较小，可以忽略不计；而测量重复性因素引入的不确定度分量（A类不确定度）则占合成不确定度的主要部分，可单独采用重复性和再现性数据来评定测量不确定度，即采用A 类评定测量不确定度。
微生物定量测试结果不是正态分布而是属于偏态分布，数据发散性比较大，若直接用贝塞尔公式计算合并样本标准差，则计算出的合并样本标准差很大，当样本均值较小时其不确定度则会过大，因此采用检测结果对数值计算合并样本标准偏差的方法进行食品中菌落总数不确定度的评定更为合理。
本实验依据GB/T4789.2-2010《食品卫生微生物学检验》中的检测方法，每个试样仅平行检测两份，取其平均值报告菌落总数。将测试所得结果转换成对数使其分布接近正态分布（样本检验结果对数值的均值和残差平方和），后再进行测量不确定度的评定。表1为检测结果、检测结果对数值、对数值的平均值、残差平方和及检测结果可取值期间（置信度95%）。
测量不确定度评定具体过程如下：
（1）共测量20份食品样，每份样品测量两次，列出第j个食品样的两次测量结果X1J和X2J，见表1。
（2）对测量结果X1J和X2J取对数，分别得到lg x1j和lg x2j以及两者的平均值，见表1。
（3）对每一个试样分别计算其残差的平方和： ，见表1。
（4）由各样品的残差平方和，通过贝塞尔公式计算20个试样合并样本标准差，得到：
（5）每个样品测量两次，故两次测量平均值的标准不确定度为：
（6）根据置信概率p=0.95和自由度v=20，由t分布表得到包含因子k95=2.09。于是扩展不确定度
3.2 结果分析
当检测结果以平行样品对数值表示时，其取值区间表示如下：
+，即： 之间。
根据每一样品的取值范围，由反对数得到每一样品菌落总数的所在区间。以第3个样品为例，的取值范围为4.5074≤≤4.6238，取反对数得到食品样2次测试平均值的取值区间为32170～42058CFU/ml。基于本次方法所得的不确定度，第3个食品样中菌落总数的测试结果可估算在32000～42000 CFU/ml之间。对于第8个样品，的取值范围为4.0809≤≤4.1973，取反对数得到食品样2次测试平均值的取值区间为12049～15752 CFU/ml。基于本次方法所得的不确定度，第8个食品样中菌落总数的测试结果可估算在12000～16000 CFU/ml。
4 结语
测量不确定度是测量技术的重要概念，是衡量测试结果准确性和可靠性的重要参数。由于微生物的特性，国家食品卫生法中规定微生物检验结果不能复检。而菌落总数检验结果是衡量产品卫生质量是否合格的依据之一，当使用检测值与限量标准进行比较判定时，会出现检测值在限量标准附近的产品，为了确保产品卫生质量是真正符合标准的，因此就必须确认检测结果是客观准确，从而有必要对产品微生物检测结果进行不确定度评定。
同时，测量不确定度的评定也是实验室质量管理体系的重要组成部分和实验室质量管理的重要内容，为了符合CNAS对检验实验室以及实验检测人员关于不确定度评估的要求，实验室应严格制定不确定度的评估程序，并对日常检测结果进行不确定度的评定，避免各方因测量条件的不同对检测结果引起争议，有效的降低检测风险和提高工作效益。
参考文献
[1]国家质量技术监督局计量司.测量不确定度评定与表示指南[M].北京：中国计量出版社，2001.
[2]ISO/IEC17025：2005.检测和校准实验室能力的通用要求[S].北京：中国实验室国家认可委员会，2005（9）.
[3]CNAS-CL01：2006.检测和校准实验室能力认可准则[S].北京：中国合格评定国家认可委员会，2006（5）.
关键词：不确定度 食品微生物检测 准确度
中图分类号：TS207.4 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2014）12-0026-02
测量不确定度是为表征合理地赋予被测量之值的分散性，与测量结果相联系的参数[1]。一个完整的测量结果除了给出最佳估计值外，还要对其进行不确定度评定，以确保定量测量的准确度及精密度。目前国内外机构对检测和校准实验室能力或资质进行认证时都非常重视测量不确定度评估，例如《检测和校准实验室能力的通用要求ISO/IEC17025》及CNAS-CL01《检测和校准实验室能力认可准则》 中都明确规定适当时要对测量结果的不确定度进行评定[2]、[3]。
本文通过对实验室自制的20份食品样中的菌落总数进行检测、分析检测结果中不确定度来源、建立数学模型对检测结果进行不确定度评定，为实验室微生物定量检测（包括菌落总数、霉菌及酵母等）的准确度和精密度提供理论依据和实践指导。
1 材料和方法
1.1 检测样品
20份实验室自制的均匀液体食品样。
1.2 检测器材
生化培养箱（36±1℃）、超净工作台、全自动高压蒸汽灭菌器、圆周振荡器、多功能电热鼓风烘箱（46±1℃）、天平（感量0.1g）、刻度移液管（10ml，1ml）。
1.3 培养基和试剂
平板计数琼脂培养基（Merck，按瓶上说明配制，灭菌后备用），无菌生理盐水（0.85%NaCl，灭菌备用）。
1.4 检测方法
依据GB4789.1—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验总则》[4]及GB4789.2—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定方法标准》[5]对食品样中菌落总数进行测定。
1.5 评定方法
依据JJF 1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》确认菌落总数检测结果的不确定度和置信空间。
2 分析不确定度来源及建立测量模型
2.1 测量不确定度来源分析
本次食品样中菌落总数测定的不确定度分量的来源主要有以下几个方面：
（1）重复性引入的不确定度，包括测试环境、培养时间、培养温度、结果修约、样品的均匀性、取样的重复性、人员的计数等；（2）培养条件引入的不确定度，包括培养时间允差、培养温度允差；（3）取样引入的不确定度，包括稀释体积、取样体积；（4）仪器与试剂引入的不确定度，包括所使用的移液管和培养基等；（5）样品保存条件引入的不确定度，包括保存温度和保存时间等。不确定度的来源分析（见图1）。
2.2 测量模型的建立
根据测量原理得到食品样中菌落总数测定数学模型为：
其中，Y为食品样中菌落总数结果（CFU/ml）；X1及X2分别为食品样二次平行检测的菌落总数结果（CFU/ml）。
3 结果与分析
3.1 菌落总数标准不确定度的评定
微生物检验属于非严格性、非度量学和非统计学一类，其特点是同一样品的检测结果相差比较大。因此，相对于化学物资、物理量值等其他类型的定量分析，菌落总数检测中由检测仪器最大容许误差、样品稀释和取样过程等因素引入的不确定度分量（B类不确定度）对合成不确定贡献较小，可以忽略不计；而测量重复性因素引入的不确定度分量（A类不确定度）则占合成不确定度的主要部分，可单独采用重复性和再现性数据来评定测量不确定度，即采用A 类评定测量不确定度。
微生物定量测试结果不是正态分布而是属于偏态分布，数据发散性比较大，若直接用贝塞尔公式计算合并样本标准差，则计算出的合并样本标准差很大，当样本均值较小时其不确定度则会过大，因此采用检测结果对数值计算合并样本标准偏差的方法进行食品中菌落总数不确定度的评定更为合理。
本实验依据GB/T4789.2-2010《食品卫生微生物学检验》中的检测方法，每个试样仅平行检测两份，取其平均值报告菌落总数。将测试所得结果转换成对数使其分布接近正态分布（样本检验结果对数值的均值和残差平方和），后再进行测量不确定度的评定。表1为检测结果、检测结果对数值、对数值的平均值、残差平方和及检测结果可取值期间（置信度95%）。
测量不确定度评定具体过程如下：
（1）共测量20份食品样，每份样品测量两次，列出第j个食品样的两次测量结果X1J和X2J，见表1。
（2）对测量结果X1J和X2J取对数，分别得到lg x1j和lg x2j以及两者的平均值，见表1。
（3）对每一个试样分别计算其残差的平方和： ，见表1。
（4）由各样品的残差平方和，通过贝塞尔公式计算20个试样合并样本标准差，得到：
（5）每个样品测量两次，故两次测量平均值的标准不确定度为：
（6）根据置信概率p=0.95和自由度v=20，由t分布表得到包含因子k95=2.09。于是扩展不确定度
3.2 结果分析
当检测结果以平行样品对数值表示时，其取值区间表示如下：
+，即： 之间。
根据每一样品的取值范围，由反对数得到每一样品菌落总数的所在区间。以第3个样品为例，的取值范围为4.5074≤≤4.6238，取反对数得到食品样2次测试平均值的取值区间为32170～42058CFU/ml。基于本次方法所得的不确定度，第3个食品样中菌落总数的测试结果可估算在32000～42000 CFU/ml之间。对于第8个样品，的取值范围为4.0809≤≤4.1973，取反对数得到食品样2次测试平均值的取值区间为12049～15752 CFU/ml。基于本次方法所得的不确定度，第8个食品样中菌落总数的测试结果可估算在12000～16000 CFU/ml。
4 结语
测量不确定度是测量技术的重要概念，是衡量测试结果准确性和可靠性的重要参数。由于微生物的特性，国家食品卫生法中规定微生物检验结果不能复检。而菌落总数检验结果是衡量产品卫生质量是否合格的依据之一，当使用检测值与限量标准进行比较判定时，会出现检测值在限量标准附近的产品，为了确保产品卫生质量是真正符合标准的，因此就必须确认检测结果是客观准确，从而有必要对产品微生物检测结果进行不确定度评定。
同时，测量不确定度的评定也是实验室质量管理体系的重要组成部分和实验室质量管理的重要内容，为了符合CNAS对检验实验室以及实验检测人员关于不确定度评估的要求，实验室应严格制定不确定度的评估程序，并对日常检测结果进行不确定度的评定，避免各方因测量条件的不同对检测结果引起争议，有效的降低检测风险和提高工作效益。
参考文献
[1]国家质量技术监督局计量司.测量不确定度评定与表示指南[M].北京：中国计量出版社，2001.
[2]ISO/IEC17025：2005.检测和校准实验室能力的通用要求[S].北京：中国实验室国家认可委员会，2005（9）.
[3]CNAS-CL01：2006.检测和校准实验室能力认可准则[S].北京：中国合格评定国家认可委员会，2006（5）.