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摘要：利用GenBank数据库中科鱼线粒体ND6基因序列保守区设计引物，采用PCR技术克隆并测序，共得到12尾巨ND6基因全序列。用DNAMAN 5.0软件比对序列，MEGA 5.0软件分析科不同鱼类的进化关系，结果表明：巨ND6基因序列全长为516 bp，碱基含量分别为14.20%、34.50%、40.20%、11.00%，其中“A T”含量（54.40%）高于“G C”含量 （45.50%），存在4个单倍型，发生3次颠换；12个个体4个单倍型间的平均相对遗传距离为0.003；将巨与其他14种鱼类的ND6基因用Neighbore-Joining（NJ）法构建系统发育树，发现巨单独聚为1支。研究将为今后鱼类线粒体基因组的研究提供科学依据。
关键词：巨；线粒体；ND6基因；多态性；系统进化
中图分类号： S917.4
文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2016）04-0062-04
巨（Bagarius yarrelli Sykes）是云南省特有鱼类，主要分布于元江、澜沧江、怒江流域，属于鲇形目（Siluriforme）科（Sisoridae）属（Bagarius）。巨个体很大，体质量约 50 kg，全身无鳞，皮肤表面布满细密的微小颗粒物，使其皮肤极为粗糙，此外其体表无黏液，身体背面颜色为灰黄色，腹面为白色，肌肉为黄色，所以又称“黄鱼”[1]。巨为底栖肉食性鱼类，具有口宽、上下颌都有齿带、牙齿呈锥形且排列紧密、鳃耙粗短、胃大、肠短等特点，主要食物为鱼类、虾、泥鳅、水生昆虫[2]。田树魁等通过比较巨、叉尾鲇、斑点叉尾3种鱼肌肉中常规营养成分和氨基酸含量，发现巨肌肉中蛋白质、粗脂肪和必需氨基酸的含量比常规鱼类高，是一种具有较高营养价值的有待驯养开发的野生鱼类[3]。杜民等研究表明，野生巨具有较高的遗传多样性[4]。但是由于地理环境的改变和人为因素的影响，野生可利用的巨资源越来越少。为了保护该鱼类，薛晨江等开展了巨的人工驯养，并取得初步成功[5]。
鱼类线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是细胞核外（细胞质中）具有转录、自主复制和翻译能力的共价闭合环状双链DNA[6]。鱼类的mtDNA主要包括37个基因（22个tRNA编码基因、13个疏水蛋白基因、2个rRNA基因）；其中13个疏水蛋白基因编码的多肽中包含了7个氢化辅酶 Ⅰ （nicotinamide adenine diuncleotide hydrogen，NADH）脱氢酶的亚单位（ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、ND6）。ND6蛋白编码基因位于L链上，处于细胞色素b与ND4之间的连续区域，是线粒体内膜呼吸链的重要组成成分[7]。在氢化辅酶中，由于ND6基因序列不易发生变异，进化速度一般，且基因片段不长，因此常用来研究物种的遗传多样性、种群之间的亲缘关系以及系统进化关系[8]。方月琴等用复合扩增体系，选择线粒体ND6基因进行种属鉴定，结果表明，该方法可以将13种不同的动物区分开来[9]。也有研究表明，ND6基因与人类疾病帕金森氏症等发生有关[10]，ND6基因还被用于研究鸟类的亲缘关系[11]，但是大多应用于鱼类群体和亚种间的遗传变异研究[12-13]。对巨的线粒体ND6基因全序列进行检测分析，进而分析巨遗传结构、变异及与其他物种之间的同源差异，可为今后巨鱼种研究提供一定的试验数据与理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
本研究采用的12尾巨采自云南省河口县。剪取肌肉组织放于1.5 mL EP管中，贴上对应标签，再加入无水乙醇，于4 ℃保存备用。
1.2 试验方法
1.2.1 基因组DNA的提取及多态性引物筛选 DNA的提取参考Sambrook等的酚/氯仿抽提法[14]。用凝胶成像系统观察、照相记录后，将提取的DNA贮存在-20 ℃冰箱中备用。
根据GenBank数据库中已公布的科巨鱼线粒体基因组ND6基因序列（登錄号：NC_021606，JQ026260），用Primer Premier 5软件设计简并引物：上游引物：5′-GCACCTCAGAAKGATATTTGWCCYC-3′；下游引物：3′-TYTAAACAGCCCGAAGCGC MC-5′，在PCR扩增仪上进行扩增，反应体系见表1。
PCR反应条件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 50 s，72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃延伸6 min；4 ℃保存。PCR产物用1%琼脂糖凝胶在120 V电压下电泳35 min，最后通过凝胶成像系统得到PCR产物条带并照相。
检测后的PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，在紫外分析仪下切下目的片段，用DNA凝胶回收试剂盒（天根生物科技有限公司）进行回收纯化，具体步骤参照回收试剂盒说明书进行。
1.2.2 目的DNA片段的连接与转化 用pMD18-T载体与目的DNA进行连接、转化，具体步骤参照载体连接试剂盒说明书进行，用LB培养基进行扩大养后用M13进行阳性克隆筛选，送交南京金斯瑞科技生物公司测序。
1.3 数据分析
利用DNAMAN 5.0软件将测得的巨线粒体ND6基因部分序列与参照物种ND6基因部分序列进行比对。利用MEGA 5.0软件中的Kimura2-parameter方法计算遗传距离，采用邻接法（Neighbore-Joining，NJ）中的Maximum Composite Likelihood法构建系统发育树，通过自举检验（Bootstrap）获得系统分支的置信度（重复1 000次）。
2 结果与分析
2.1 DNA提取
从巨鱼鳍条或肌肉提取DNA，结果见图1。可以看出，DNA条带清晰。 2.2 引物退火温度的优化
用设计的Bayam18引物退火温度的±10 ℃范围进行梯度PCR（图2），所用marker为BM2000，Bayam18引物的退火温度梯度见表2。由图2可知，Bayam18号引物能扩增出条带的温度为55、55.6、56.4、57.5、59.2、60.7、61.9 ℃，根据条带明亮度，初步确定Bayam18引物最适的退火温度。
2.3 扩增产物与DNA回收
利用凝胶回收试剂盒对PCR产物（图3）进行回收，回收产物（图4）于-20 ℃保存。
2.4 菌液退火温度优化
通过梯度PCR优化M13通用引物的退火温度（图5）。M13通用引物序列见表3，退火温度梯度见表4。由图5可知，M13通用引物在每个泳道都扩增出了明亮条带。
2.5 巨鱼ND6基因序列的碱基含量
本试验中，利用下载序列通过DNAMAN 5.0软件对比排位，得到ND6基因片段长度516 bp，12条序列中发现4个单倍型，其中6号、7号、11号个体序列相同，为1#单倍型；1号、3号、4号、5号、8号、9号、12号个体序列相同，为2#单倍型；10号个体为3#单倍型；2号个体为4#单倍型。采用 MEGA 5.0软件计算它们的碱基组成（表5），可以得出T、C、A、G 4种碱基含量分别为14.10%、34.80%、40.10%、11.00%，其中“A T”含量（ 54.20%）高于“G C”含量（45.80%）。
2.6 巨鱼ND6基因12个个体的相对遗传距离
用MEGA 5.0软件中的双参数法，通过转换加颠换、转换比颠换分别计算12个个体之间的相对遗传距离[15]，详见表6。由表6可知，12个个体的4个单倍型之间的差异（转换加颠换）为0.002～0.004。
2.7 基于ND6基因构建系统发育树
将巨鱼ND6基因与其他14物种（表7）进行比对，用MEGA5.0软件构建系统发育树[16-17]，从图6可以看出，系统发育树分为两大支，巨单独聚为1支。
3 讨论与分析
本试验通过从GenBank数据库中查询已公布的科巨线粒体基因组中ND6基因序列保守区设计引物，采用PCR反应扩增、克隆及测序巨ND6基因，共得到12条ND6基因全序列。对巨线粒体ND6基因序列进行研究，得到ND6基因全序列长516 bp。
利用MEGA 5.0软件分析对巨鱼线粒体ND6基因12个个体进行分析，得到T、C、A、G这4种碱基含量分别为14.10%、34.80%、40.10%、11.00%，其中“A T”含量（54.20%）高于“G C”含量（45.80%），说明ND6基因序列中富含碱基A、T。共发现4个单倍型，3个变异位点，都为单突变位点，表明ND6基因序列多态性贫乏，序列之间差异不大，这与赖瑞芳等比较鲂属鱼类线粒体基因组，研究鲂属鱼类系统发育的结果[18]是一致的。ND6基因序列共发生3次颠换，表明本研究的4个单倍型的ND6基因核苷酸变异类型以
颠换为主。12个个体的4个单倍型之间平均相对遗传距离为0.003，转换和颠换的比值为0.667，表明这12个个体之间亲缘性近，ND6基因序列变异并不显著，这与于美玲等对科鱼类系统发育关系的研究结果[19]一致。
此外，由系统发育树可知，系统发育树分为两大支，其中巨单独聚成1支，置信值为100%，表明与其他14种科鱼亲缘性远。另一支又分为2支，分别是细尾、长丝黑先聚为1支，黄石爬、黑斑原先聚为1支后，这4个种类进而聚为一个大的分支后与本研究的4个巨聚在一起。大鳍异齿和中华先聚为1支，二者与三线纹胸聚在一起后与中华纹胸聚为1支，再与藏聚在一起，然后与黄斑褶聚为较大的分支。巨单独聚成1支，这与形态学分类结果与基于细胞色素b（Cytochrome b）、rpS7基因研究的遗传进化是一致的[20-21]。本研究通过研究巨鱼ND6基因序列多态性，可为以后研究巨与其他鱼类的亲缘性、系统进化等研究提供科学依据。
参考文献：
[1]田树魁，薛晨江，冷 云，等. 巨的生物學特性初步研究[J]. 水生态学杂志，2009，30（3）：115-117.
[2]冷 云，田树魁，刘跃天，等. 巨食性初步研究[J]. 现代农业科技，2011，37（19）：329-330.
[3]田树魁，易 勇，薛晨江，等. 野生巨肌肉营养成分测定和分析[J]. 淡水渔业，2009，39（3）：73-76.
[4]杜 民，牛宝珍，罗彩艳，等. 巨野生群体遗传多样性的RAPD分析[J]. 淡水渔业，2015，45（1）：15-19，24.
[5]薛晨江，张正雄，马建颜，等. 巨人工繁殖初报与胚胎发育观察[J]. 水生态学杂志，2012，33（5）：54-56.
[6]吕国庆，李思发. 鱼类线粒体 DNA 多态研究和应用进展[J]. 中国水产科学，1998，5（3）：95-104.
[7]陈四海，区又君，李加儿. 鱼类线粒体DNA及其研究进展[J]. 生物技术通报，2011，27（3）：13-20.
[8]海 汀，柴志欣，张成福，等. 西藏牦牛mtDNA ND6遗传多样性及系统进化分析[J]. 家畜生态学报，2014，35（11）：11-17.
[9]方月琴，顾 准，侯一平. 线粒体基因种属鉴定复合扩增体系[J]. 盐城工学院学报：自然科学版，2012，25（1）：19-24.
[10]Piccoli C，Ripoli M，Quarato G，et al. Coexistence of mutations in PINK1 and mitochondrial DNA in early onset Parkinsonism[J]. Journal of Medical Genetics，2008，45（9）：596-602. [11]陈晓芳，王 翔，袁晓东，等. 鸻形目15种鸟类线粒体ND6基因序列差异及其系统进化关系[J]. 动物学报，2003，49（1）：61-66.
[12]袁 娟，张其中，罗 芬. 鱼类线粒体DNA及其在分子群体遗传研究中的应用[J]. 生态科学，2008，27（4）：272-276.
[13]郭新红，刘少军，刘 巧. 鱼类线粒体DNA研究新进展[J]. 遗传学报，2004，31（9）：983-1000.
[14]Sambroo J，Fitch E，Maniatis T. Molecular cloning：a laboratory manual[M]. 2nd ed. New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989：1024-1031.
[15]Tamura K，Nei M，Kumar S. Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2004，101（30）：11030-11035.
[16]Saitou N，Nei M. The neighbor-joining method：a new method for reconstructing phylogenetic trees[J]. Molecular Biology and Evolution，1987，4（4）：406-425.
[17]Dopazo J. Estimating errors and confidence intervals for branch lengths in phylogenetic trees by a bootstrap approach[J]. Journal of Molecular Evolution，1994，38（3）：300-304.
[18]賴瑞芳，张秀杰，李艳和，等. 鲂属鱼类线粒体基因组的比较及其系统发育分析[J]. 水产学报，2014，38（1）：1-14.
[19]于美玲，何舜平.科鱼类系统发育关系分析及其分歧时间估算[J]. 中国科学：生命科学，2012，42（4）：277-285.
[20]周 伟，李 旭，杨 颖.中国科群系统发育与地理分布格局研究进展[J]. 动物学研究，2005，26（6）：673-679.
[21]李 旭. 中国鲇形目科群鱼类的系统发育及生物地理学分析[D]. 昆明：西南林业大学，2006.徐佳杰，姜 波，朱建一，等. 红毛菜28S rDNA和IGS序列分析及系统发育[J]. 江苏农业科学，2016，44（4）：66-69.
关键词：巨；线粒体；ND6基因；多态性；系统进化
中图分类号： S917.4
文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2016）04-0062-04
巨（Bagarius yarrelli Sykes）是云南省特有鱼类，主要分布于元江、澜沧江、怒江流域，属于鲇形目（Siluriforme）科（Sisoridae）属（Bagarius）。巨个体很大，体质量约 50 kg，全身无鳞，皮肤表面布满细密的微小颗粒物，使其皮肤极为粗糙，此外其体表无黏液，身体背面颜色为灰黄色，腹面为白色，肌肉为黄色，所以又称“黄鱼”[1]。巨为底栖肉食性鱼类，具有口宽、上下颌都有齿带、牙齿呈锥形且排列紧密、鳃耙粗短、胃大、肠短等特点，主要食物为鱼类、虾、泥鳅、水生昆虫[2]。田树魁等通过比较巨、叉尾鲇、斑点叉尾3种鱼肌肉中常规营养成分和氨基酸含量，发现巨肌肉中蛋白质、粗脂肪和必需氨基酸的含量比常规鱼类高，是一种具有较高营养价值的有待驯养开发的野生鱼类[3]。杜民等研究表明，野生巨具有较高的遗传多样性[4]。但是由于地理环境的改变和人为因素的影响，野生可利用的巨资源越来越少。为了保护该鱼类，薛晨江等开展了巨的人工驯养，并取得初步成功[5]。
鱼类线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是细胞核外（细胞质中）具有转录、自主复制和翻译能力的共价闭合环状双链DNA[6]。鱼类的mtDNA主要包括37个基因（22个tRNA编码基因、13个疏水蛋白基因、2个rRNA基因）；其中13个疏水蛋白基因编码的多肽中包含了7个氢化辅酶 Ⅰ （nicotinamide adenine diuncleotide hydrogen，NADH）脱氢酶的亚单位（ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、ND6）。ND6蛋白编码基因位于L链上，处于细胞色素b与ND4之间的连续区域，是线粒体内膜呼吸链的重要组成成分[7]。在氢化辅酶中，由于ND6基因序列不易发生变异，进化速度一般，且基因片段不长，因此常用来研究物种的遗传多样性、种群之间的亲缘关系以及系统进化关系[8]。方月琴等用复合扩增体系，选择线粒体ND6基因进行种属鉴定，结果表明，该方法可以将13种不同的动物区分开来[9]。也有研究表明，ND6基因与人类疾病帕金森氏症等发生有关[10]，ND6基因还被用于研究鸟类的亲缘关系[11]，但是大多应用于鱼类群体和亚种间的遗传变异研究[12-13]。对巨的线粒体ND6基因全序列进行检测分析，进而分析巨遗传结构、变异及与其他物种之间的同源差异，可为今后巨鱼种研究提供一定的试验数据与理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
本研究采用的12尾巨采自云南省河口县。剪取肌肉组织放于1.5 mL EP管中，贴上对应标签，再加入无水乙醇，于4 ℃保存备用。
1.2 试验方法
1.2.1 基因组DNA的提取及多态性引物筛选 DNA的提取参考Sambrook等的酚/氯仿抽提法[14]。用凝胶成像系统观察、照相记录后，将提取的DNA贮存在-20 ℃冰箱中备用。
根据GenBank数据库中已公布的科巨鱼线粒体基因组ND6基因序列（登錄号：NC_021606，JQ026260），用Primer Premier 5软件设计简并引物：上游引物：5′-GCACCTCAGAAKGATATTTGWCCYC-3′；下游引物：3′-TYTAAACAGCCCGAAGCGC MC-5′，在PCR扩增仪上进行扩增，反应体系见表1。
PCR反应条件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 50 s，72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃延伸6 min；4 ℃保存。PCR产物用1%琼脂糖凝胶在120 V电压下电泳35 min，最后通过凝胶成像系统得到PCR产物条带并照相。
检测后的PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，在紫外分析仪下切下目的片段，用DNA凝胶回收试剂盒（天根生物科技有限公司）进行回收纯化，具体步骤参照回收试剂盒说明书进行。
1.2.2 目的DNA片段的连接与转化 用pMD18-T载体与目的DNA进行连接、转化，具体步骤参照载体连接试剂盒说明书进行，用LB培养基进行扩大养后用M13进行阳性克隆筛选，送交南京金斯瑞科技生物公司测序。
1.3 数据分析
利用DNAMAN 5.0软件将测得的巨线粒体ND6基因部分序列与参照物种ND6基因部分序列进行比对。利用MEGA 5.0软件中的Kimura2-parameter方法计算遗传距离，采用邻接法（Neighbore-Joining，NJ）中的Maximum Composite Likelihood法构建系统发育树，通过自举检验（Bootstrap）获得系统分支的置信度（重复1 000次）。
2 结果与分析
2.1 DNA提取
从巨鱼鳍条或肌肉提取DNA，结果见图1。可以看出，DNA条带清晰。 2.2 引物退火温度的优化
用设计的Bayam18引物退火温度的±10 ℃范围进行梯度PCR（图2），所用marker为BM2000，Bayam18引物的退火温度梯度见表2。由图2可知，Bayam18号引物能扩增出条带的温度为55、55.6、56.4、57.5、59.2、60.7、61.9 ℃，根据条带明亮度，初步确定Bayam18引物最适的退火温度。
2.3 扩增产物与DNA回收
利用凝胶回收试剂盒对PCR产物（图3）进行回收，回收产物（图4）于-20 ℃保存。
2.4 菌液退火温度优化
通过梯度PCR优化M13通用引物的退火温度（图5）。M13通用引物序列见表3，退火温度梯度见表4。由图5可知，M13通用引物在每个泳道都扩增出了明亮条带。
2.5 巨鱼ND6基因序列的碱基含量
本试验中，利用下载序列通过DNAMAN 5.0软件对比排位，得到ND6基因片段长度516 bp，12条序列中发现4个单倍型，其中6号、7号、11号个体序列相同，为1#单倍型；1号、3号、4号、5号、8号、9号、12号个体序列相同，为2#单倍型；10号个体为3#单倍型；2号个体为4#单倍型。采用 MEGA 5.0软件计算它们的碱基组成（表5），可以得出T、C、A、G 4种碱基含量分别为14.10%、34.80%、40.10%、11.00%，其中“A T”含量（ 54.20%）高于“G C”含量（45.80%）。
2.6 巨鱼ND6基因12个个体的相对遗传距离
用MEGA 5.0软件中的双参数法，通过转换加颠换、转换比颠换分别计算12个个体之间的相对遗传距离[15]，详见表6。由表6可知，12个个体的4个单倍型之间的差异（转换加颠换）为0.002～0.004。
2.7 基于ND6基因构建系统发育树
将巨鱼ND6基因与其他14物种（表7）进行比对，用MEGA5.0软件构建系统发育树[16-17]，从图6可以看出，系统发育树分为两大支，巨单独聚为1支。
3 讨论与分析
本试验通过从GenBank数据库中查询已公布的科巨线粒体基因组中ND6基因序列保守区设计引物，采用PCR反应扩增、克隆及测序巨ND6基因，共得到12条ND6基因全序列。对巨线粒体ND6基因序列进行研究，得到ND6基因全序列长516 bp。
利用MEGA 5.0软件分析对巨鱼线粒体ND6基因12个个体进行分析，得到T、C、A、G这4种碱基含量分别为14.10%、34.80%、40.10%、11.00%，其中“A T”含量（54.20%）高于“G C”含量（45.80%），说明ND6基因序列中富含碱基A、T。共发现4个单倍型，3个变异位点，都为单突变位点，表明ND6基因序列多态性贫乏，序列之间差异不大，这与赖瑞芳等比较鲂属鱼类线粒体基因组，研究鲂属鱼类系统发育的结果[18]是一致的。ND6基因序列共发生3次颠换，表明本研究的4个单倍型的ND6基因核苷酸变异类型以
颠换为主。12个个体的4个单倍型之间平均相对遗传距离为0.003，转换和颠换的比值为0.667，表明这12个个体之间亲缘性近，ND6基因序列变异并不显著，这与于美玲等对科鱼类系统发育关系的研究结果[19]一致。
此外，由系统发育树可知，系统发育树分为两大支，其中巨单独聚成1支，置信值为100%，表明与其他14种科鱼亲缘性远。另一支又分为2支，分别是细尾、长丝黑先聚为1支，黄石爬、黑斑原先聚为1支后，这4个种类进而聚为一个大的分支后与本研究的4个巨聚在一起。大鳍异齿和中华先聚为1支，二者与三线纹胸聚在一起后与中华纹胸聚为1支，再与藏聚在一起，然后与黄斑褶聚为较大的分支。巨单独聚成1支，这与形态学分类结果与基于细胞色素b（Cytochrome b）、rpS7基因研究的遗传进化是一致的[20-21]。本研究通过研究巨鱼ND6基因序列多态性，可为以后研究巨与其他鱼类的亲缘性、系统进化等研究提供科学依据。
参考文献：
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[2]冷 云，田树魁，刘跃天，等. 巨食性初步研究[J]. 现代农业科技，2011，37（19）：329-330.
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[12]袁 娟，张其中，罗 芬. 鱼类线粒体DNA及其在分子群体遗传研究中的应用[J]. 生态科学，2008，27（4）：272-276.
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