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【摘要】本文介绍近年来对大豆异黄酮的研究概况，包括大豆异黄酮的提取分离、含量测定、生理活性及其在体内的吸收代谢进行了讨论和展望。
【关键词】大豆异黄酮；雌激素；提取分离；含量测定；生物活性自由基；生理机能
大豆异黄酮（Soybean Isoflavone，SIF）是大豆成分中的一种非营养素，它能和雌激素受体（ER）相结合，发挥其生物活性，具有和雌激素类似的生物作用，因此，被称为植物雌激素（phytoestrogen）。近年来，对大豆生物化学的研究发现，SIF具有抗癌、抗氧化、消除自由基、预防骨质疏松、预防心血管疾病、改善妇女更年期综合征等生物作用。
1SIF的成分及提取分离
1.1大豆异黄酮的成分及原料处理对其影响大豆异黄酮是在大豆生长过程中二次代谢所形成的物质，在大豆总成分含量中仅占到0.04%-0.5%。目前，研究发现大豆异黄酮包含有12种化合物，其中主要包含三种游离型苷元，分别是大豆黄素（glycitein）、大豆苷元（daidzein）、染料木素（genistein），这三种苷元主要是以相对应的β-葡萄糖苷的形式存在，而在大豆籽粒异黄酮中的游离型苷元含量较低；大豆异黄酮所包含的葡萄糖苷中，部分葡萄糖C-6羟基被丙二酰基所代替，另有一部分葡萄糖C-6羟基被乙酰基所代替[1]。大豆异黄酮中的糖苷被丙二酰化后，具有较强的水溶性，但不耐热，其溶液在热作用下易发生变性，分解变成糖苷，在干热的作用下脱羧基转变成乙酰糖苷[2]。发酵、发芽或β-葡萄糖酶解能让糖苷转化为苷元，因此，在发酵豆制品（丹贝、淡豆豉）中游离型大豆异黄酮的含量要比大豆籽粒中的含量明显增高。总之，对大豆进行加热或发酵，不会消除异黄酮，而仅能改变异黄酮的存在形式。另外，对大豆进行水洗处理可使异黄酮的含量大幅度地降低。
1.2SIF的提取分离目前，提取分离大豆异黄酮所用的原料主要是豆饼、豆粕、脱脂大豆片及豆渣，用含水乙醇或丙酮对原料进行浸泡，对溶液进行浓缩，分离加工可以初步得到比较粗糙的异黄酮，再用葡聚糖凝胶柱或聚酰胺柱进行深处理加工能得到较纯的异黄酮，如果利用超滤膜分离技术能得到更高纯度的异黄酮[3]。专门研究提取SIF的专家称，利用二步水解法能提取大豆异黄酮苷元产品，第一步，使用0.3%的乙酸溶液在80的℃水中对原料进行分解，时间要持续15小时，能使丙二酰糖苷转化为糖苷元；第二步，使用5%浓度的硫酸在80℃的水中对原料进行分解，时间持续20小时，可以使糖苷转化为苷元，再进行浓缩、抽滤、洗涤、烘干等程序得到大豆苷元粗品，再通过溶剂结晶处理能增加大豆苷元的纯度[4]。
对豆类原料用工业技术或手段来提取大豆异黄酮的研究较少，也鲜有报道，且工业提取的方法多属于未公开状态，其大体的提取工序可以总结为如下几步：浸提、浓缩、沉淀、调pH值、吸附分离、树脂分离、滤液喷雾干燥，得出成品。
2 SIF的分布
SIF是以2-苯基色酮为主的化合物群，是一种混合物。1931年Walz从豆奶中利用甲醇第一次分离提取出SIF[1]；SIF也是一种植物化学素，主要存在于豆科蝶形花亚科植物中，属于植物黄酮，它在不同的植物中的含量也不相同，在大豆中的含量较高，一般能占到其成分总量的0.1%-0.5%[5]。不同地区种植的大豆，或大豆种植的条件不同，在其中的含量也不相同，异黄酮含量还受到大豆贮存时间、大豆的品种、颗粒大小及大豆不同部位的影响而含量不同。大豆的种皮、胚轴及子叶中都含有SIF，子叶、胚轴中含量较高，其中子叶中异黄酮的含量占到80%-90%，浓度为0.1%-0.3%。胚轴中异黄酮种类较多，含量也较高，占SIF总含量的30%-50%，浓度为1%-2%，浓度为子叶中异黄酮浓度的30-60倍[6]，而在种皮中含量不高[1]。大豆中染料木素约占异黄酮的50%-60%，大豆甙元约占30%-35%，黄豆黄素约占5%-15%。且在不同的原料中含量也不相同[7]。大豆中异黄酮主要是以二酰基配糖体的形式存在，乙酰配糖体及配基的存在形式较少。
3SIF的含量测定
3.1紫外分光光度法（UV）这种检测方法易于操作，是检测制剂中总异黄酮或粗提物的有效的方法。它的原理是根据异黄酮类化合物中的羟基及芳环所形成的共轭体系对50-260nm紫外光线具有强烈的吸收性，因此，可以通过测定其中的一种成分对照测量总异黄酮的水平[8]。张玉梅等[8]以Genistein为对照，利于259nm紫外光成功测定了大豆中提取的异黄酮总量。
3.2高压液相色谱法（HPLC）该方法能准确地检测出大豆中提取的异黄酮含量，对检测仪器的选择上也具有多样性。江和源等[11]以30：3.5：66.5的比例配制甲醇-醋酸-水作为流动相，通过ODS柱准确地检测出定量葛根中的异黄酮含量；毛峻琴等[10]以10：10：1的比例配制甲醇-水-乙酸作為流动相，检测波长为260nm，通过YWG-C18柱成功测出了淡豆豉中异黄酮苷元含量；谷利伟等[2]利用高压液相色谱法对大豆胚芽中的异黄酮先进行了定性分析，再具体做了定量研究，回答了微量和不稳定异黄酮的色谱峰如何定性的难题。
3.3薄层扫描法（TLCS）该方法不用大量取样，便于操作，提取分离效果理想，还能对多种成分进行定量分析。赵世萍等[9]以7：3：0.02的比例配制甲苯-甲醇-10%甲酸，以8：2：0.2的比例来配制乙酸乙酯-甲醇-50%甲酸，作为展开剂，利用硅胶G薄层板，对大豆苷元、大豆苷等成分进行了成功地分离，并通过双波长反射锯齿扫描对各成分的含量进行的测定。笔者以前以4：2：2：1的比例配制乙酸乙酯-三氯甲烷-甲醇-水，以低于10℃的下层溶液作为展开剂，应用硅胶GF254薄层板，成功分离了大豆提取物中的异黄酮，各层次扫描效果良好，能对苷和苷元一起进行定量分析。
3.4其他测定方法在外国还有用免疫检测法[14]、毛细管电泳法（CE）[13]及气相色谱法（GC）[12]等方法成功检测出血样、尿样中含有一定量的大豆异黄酮。 4SIF的化学特性
SIF苷元在水中基本上没有可溶性，而在氯仿、苯及乙醚中具有可溶性。SIF葡萄糖苷在其分子结构中有羟基极性基团，因此，在甲醇、乙醇及水中具有可溶性。SIF结构中含有酚羟基，表现为弱酸性，可以和碱结合成盐，这是SIF能够分离纯化的依据。酚羟基在三氯化铁试液中发生化学反应，产生蓝黑色、褐色及绿色物质，这能用作定性鉴别SIF。酚羟基容易发生氧化反应，能对抗氧化在生物体中发挥多种生物活性。通过加热或发酵，在酸性条件下可以水解SIF糖苷键，分解成葡萄糖和苷元，增高游离异黄酮的含量[15]。SIF的结构不同具有不同的水溶性，其中，游离的SIF糖苷配基（aglycon）最不具水溶性，结合型SIF水溶性较好，而染料木苷水溶性较差。SIF中的游离型苷元具有最高的生物活性。
5SIF的吸收及代谢
异黄酮可以通过两种途径来吸收，第一，小肠直接吸收，有研究指出，aglycon脂溶性和分子空间结构较小，小肠绒毛上皮细胞能够对其直接吸收；第二，主动运输吸收，这种观点认为，葡糖苷（Glucosides）在结肠中由细菌分泌的β-半乳糖苷酶或β-葡萄糖苷酶水解成糖元才能被结肠吸收[16]。
有专家指出，SIF葡萄糖苷基本上没有生物活性。SIF糖苷被机体摄入进入小肠后，在空肠中要经过葡萄糖苷酶水解，释放出染料木黄酮、黄豆苷元等物质，这些物质生物活性较强（染料木黄酮活性最强），且容易被肠道吸收。游离苷元是在肠道微生物的作用下，进一步代谢为对-己基苯酚和雌马酚等物质，这些代谢产物在小肠的远端还会进一步代谢，这些代谢物或糖苷配基在肠道内被吸收，再和糖醛酸结合，进入肝肠循环，再经过多次的肝肠循环，之后，大量的异黄酮苷元在肝脏内与葡萄糖醛酸结合成化合物，这种化合物具有水溶性，被进一步水解，剩余部分则以葡萄糖苷或硫酸酯的形式随尿液排出体外，还可以通过粪便直接被排出体外[17]。另有研究指出，异黄酮还能通过乳汁排出体外。异黄酮在体内的代谢有个体性差异，一般在进入人体后48小时达到药物峰值，在24小时内排出体外，其在体内的吸收及代谢还会受到饮食等其他因素的影响[18]。
综上，大豆作为人们的日常食品，具有较高的营养价值，也具有较高的安全性，近来的流行病学研究结果认为，亚洲国家结肠癌、前列腺癌及乳腺癌的发病率之所以低于西方发达国家，其中一个重要的原因就是和食用豆类食品有关。
随着对大豆磷脂、大豆异黄酮、低聚糖、植物凝血素、蛋白肽、皂苷、甾醇等生物活性物质的深入研究，将会更能发现大豆异黄酮的价值，大豆异黄酮还能作为药物被开发，其市场也将有着巨大的潜力。
参考文献
[1]王春娥，刘叔义.SIF的成分、含量及特性[J].食品科學，1998，19（4）：39-43.
[2]谷利伟，谷文英，陶冠军，等.HPLC ESI/MS法分析大豆胚芽中异黄酮-大豆异黄酮和皂苷的研究（Ⅲ）[J].中草药，2000，31（11）：821-823.
[3]葛喜珍，王建华，李恩.中药大豆中异黄酮的制备及开发利用进展[J].河北中医药学报，2001，16（2）：44-47.
[4]冯国洲.提取大豆中异黄酮的方法[J].CN 1211573A，1999.
[5]艾志录，李梦芹，李强，等.功能性成分异黄酮的来源与生理功能[J].2004，（1）：1-6.
[6]田璐，韩锋.SIF研究概况[J].大豆通报，2004，（2）：20-21.
[7]汪玉秀.SIF的研究及应用[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2003，31（10）：113-114.
[8]张玉梅，孙学斌，高旭年，等.紫外分光光度法测定大豆异黄酮含量[J].中国食品卫生杂志，2000，12（4）：7-9.
[9]赵世萍，章育中.葛根中异黄酮含量的薄层光密度法测定[J].药学学报，1985，20（3）：203-208.
[10]毛峻琴，宓鹤鸣，杨根金，等.HPLC法测定淡豆豉中异黄酮含量[J].第二军医大学学报，2000，21（10）：955-957.
[11]江和源，吕飞杰，台建祥.测定大豆和葛根中异黄酮的高效液相色谱法[J].分析测试学报，2000，19（6）：28-31.
[12]Bannwart C，Fotsis T，Heikkinen R，et al.Identification of the isofla-vonic phytoestrogen daidzein in humanurine.Clin.[J].Chim.Acta，1984，136（2-3）：165-172.
[13]Shihbi Z K，Kute T，Garccia L L，et al.Analysis of is flavones by capillary electrophoresis.J.[J].Chromatography A，1994，680：181-185.
[14]Creeke P I，Wilkinson A P，Lee H A.Development of Elisas for the measurement of the dietary phytoestrogen daidzein and equol in human plasma.[J].Food.Agric.Immunol，1998，10（4）：325-348.
[15]孙克杰，汤坚.异黄酮类化合物在不同氧化体系中的作用研究[J].食品科学，2000，22（3）：22-26.
[16]张玉梅.SIF的生物利用度[J].国外医学.卫生分册，2001，28（2）：104-106.
[17]杨薇.大豆植物性雌激素的构效关系及药理作用[J].中国新药杂志，2001，10（12）：892-896.
[18]谭桂军.SIF与疾病防治[J].天津药学Tianjin Pharmacy，2004，16（2）：64-68.
【关键词】大豆异黄酮；雌激素；提取分离；含量测定；生物活性自由基；生理机能
大豆异黄酮（Soybean Isoflavone，SIF）是大豆成分中的一种非营养素，它能和雌激素受体（ER）相结合，发挥其生物活性，具有和雌激素类似的生物作用，因此，被称为植物雌激素（phytoestrogen）。近年来，对大豆生物化学的研究发现，SIF具有抗癌、抗氧化、消除自由基、预防骨质疏松、预防心血管疾病、改善妇女更年期综合征等生物作用。
1SIF的成分及提取分离
1.1大豆异黄酮的成分及原料处理对其影响大豆异黄酮是在大豆生长过程中二次代谢所形成的物质，在大豆总成分含量中仅占到0.04%-0.5%。目前，研究发现大豆异黄酮包含有12种化合物，其中主要包含三种游离型苷元，分别是大豆黄素（glycitein）、大豆苷元（daidzein）、染料木素（genistein），这三种苷元主要是以相对应的β-葡萄糖苷的形式存在，而在大豆籽粒异黄酮中的游离型苷元含量较低；大豆异黄酮所包含的葡萄糖苷中，部分葡萄糖C-6羟基被丙二酰基所代替，另有一部分葡萄糖C-6羟基被乙酰基所代替[1]。大豆异黄酮中的糖苷被丙二酰化后，具有较强的水溶性，但不耐热，其溶液在热作用下易发生变性，分解变成糖苷，在干热的作用下脱羧基转变成乙酰糖苷[2]。发酵、发芽或β-葡萄糖酶解能让糖苷转化为苷元，因此，在发酵豆制品（丹贝、淡豆豉）中游离型大豆异黄酮的含量要比大豆籽粒中的含量明显增高。总之，对大豆进行加热或发酵，不会消除异黄酮，而仅能改变异黄酮的存在形式。另外，对大豆进行水洗处理可使异黄酮的含量大幅度地降低。
1.2SIF的提取分离目前，提取分离大豆异黄酮所用的原料主要是豆饼、豆粕、脱脂大豆片及豆渣，用含水乙醇或丙酮对原料进行浸泡，对溶液进行浓缩，分离加工可以初步得到比较粗糙的异黄酮，再用葡聚糖凝胶柱或聚酰胺柱进行深处理加工能得到较纯的异黄酮，如果利用超滤膜分离技术能得到更高纯度的异黄酮[3]。专门研究提取SIF的专家称，利用二步水解法能提取大豆异黄酮苷元产品，第一步，使用0.3%的乙酸溶液在80的℃水中对原料进行分解，时间要持续15小时，能使丙二酰糖苷转化为糖苷元；第二步，使用5%浓度的硫酸在80℃的水中对原料进行分解，时间持续20小时，可以使糖苷转化为苷元，再进行浓缩、抽滤、洗涤、烘干等程序得到大豆苷元粗品，再通过溶剂结晶处理能增加大豆苷元的纯度[4]。
对豆类原料用工业技术或手段来提取大豆异黄酮的研究较少，也鲜有报道，且工业提取的方法多属于未公开状态，其大体的提取工序可以总结为如下几步：浸提、浓缩、沉淀、调pH值、吸附分离、树脂分离、滤液喷雾干燥，得出成品。
2 SIF的分布
SIF是以2-苯基色酮为主的化合物群，是一种混合物。1931年Walz从豆奶中利用甲醇第一次分离提取出SIF[1]；SIF也是一种植物化学素，主要存在于豆科蝶形花亚科植物中，属于植物黄酮，它在不同的植物中的含量也不相同，在大豆中的含量较高，一般能占到其成分总量的0.1%-0.5%[5]。不同地区种植的大豆，或大豆种植的条件不同，在其中的含量也不相同，异黄酮含量还受到大豆贮存时间、大豆的品种、颗粒大小及大豆不同部位的影响而含量不同。大豆的种皮、胚轴及子叶中都含有SIF，子叶、胚轴中含量较高，其中子叶中异黄酮的含量占到80%-90%，浓度为0.1%-0.3%。胚轴中异黄酮种类较多，含量也较高，占SIF总含量的30%-50%，浓度为1%-2%，浓度为子叶中异黄酮浓度的30-60倍[6]，而在种皮中含量不高[1]。大豆中染料木素约占异黄酮的50%-60%，大豆甙元约占30%-35%，黄豆黄素约占5%-15%。且在不同的原料中含量也不相同[7]。大豆中异黄酮主要是以二酰基配糖体的形式存在，乙酰配糖体及配基的存在形式较少。
3SIF的含量测定
3.1紫外分光光度法（UV）这种检测方法易于操作，是检测制剂中总异黄酮或粗提物的有效的方法。它的原理是根据异黄酮类化合物中的羟基及芳环所形成的共轭体系对50-260nm紫外光线具有强烈的吸收性，因此，可以通过测定其中的一种成分对照测量总异黄酮的水平[8]。张玉梅等[8]以Genistein为对照，利于259nm紫外光成功测定了大豆中提取的异黄酮总量。
3.2高压液相色谱法（HPLC）该方法能准确地检测出大豆中提取的异黄酮含量，对检测仪器的选择上也具有多样性。江和源等[11]以30：3.5：66.5的比例配制甲醇-醋酸-水作为流动相，通过ODS柱准确地检测出定量葛根中的异黄酮含量；毛峻琴等[10]以10：10：1的比例配制甲醇-水-乙酸作為流动相，检测波长为260nm，通过YWG-C18柱成功测出了淡豆豉中异黄酮苷元含量；谷利伟等[2]利用高压液相色谱法对大豆胚芽中的异黄酮先进行了定性分析，再具体做了定量研究，回答了微量和不稳定异黄酮的色谱峰如何定性的难题。
3.3薄层扫描法（TLCS）该方法不用大量取样，便于操作，提取分离效果理想，还能对多种成分进行定量分析。赵世萍等[9]以7：3：0.02的比例配制甲苯-甲醇-10%甲酸，以8：2：0.2的比例来配制乙酸乙酯-甲醇-50%甲酸，作为展开剂，利用硅胶G薄层板，对大豆苷元、大豆苷等成分进行了成功地分离，并通过双波长反射锯齿扫描对各成分的含量进行的测定。笔者以前以4：2：2：1的比例配制乙酸乙酯-三氯甲烷-甲醇-水，以低于10℃的下层溶液作为展开剂，应用硅胶GF254薄层板，成功分离了大豆提取物中的异黄酮，各层次扫描效果良好，能对苷和苷元一起进行定量分析。
3.4其他测定方法在外国还有用免疫检测法[14]、毛细管电泳法（CE）[13]及气相色谱法（GC）[12]等方法成功检测出血样、尿样中含有一定量的大豆异黄酮。 4SIF的化学特性
SIF苷元在水中基本上没有可溶性，而在氯仿、苯及乙醚中具有可溶性。SIF葡萄糖苷在其分子结构中有羟基极性基团，因此，在甲醇、乙醇及水中具有可溶性。SIF结构中含有酚羟基，表现为弱酸性，可以和碱结合成盐，这是SIF能够分离纯化的依据。酚羟基在三氯化铁试液中发生化学反应，产生蓝黑色、褐色及绿色物质，这能用作定性鉴别SIF。酚羟基容易发生氧化反应，能对抗氧化在生物体中发挥多种生物活性。通过加热或发酵，在酸性条件下可以水解SIF糖苷键，分解成葡萄糖和苷元，增高游离异黄酮的含量[15]。SIF的结构不同具有不同的水溶性，其中，游离的SIF糖苷配基（aglycon）最不具水溶性，结合型SIF水溶性较好，而染料木苷水溶性较差。SIF中的游离型苷元具有最高的生物活性。
5SIF的吸收及代谢
异黄酮可以通过两种途径来吸收，第一，小肠直接吸收，有研究指出，aglycon脂溶性和分子空间结构较小，小肠绒毛上皮细胞能够对其直接吸收；第二，主动运输吸收，这种观点认为，葡糖苷（Glucosides）在结肠中由细菌分泌的β-半乳糖苷酶或β-葡萄糖苷酶水解成糖元才能被结肠吸收[16]。
有专家指出，SIF葡萄糖苷基本上没有生物活性。SIF糖苷被机体摄入进入小肠后，在空肠中要经过葡萄糖苷酶水解，释放出染料木黄酮、黄豆苷元等物质，这些物质生物活性较强（染料木黄酮活性最强），且容易被肠道吸收。游离苷元是在肠道微生物的作用下，进一步代谢为对-己基苯酚和雌马酚等物质，这些代谢产物在小肠的远端还会进一步代谢，这些代谢物或糖苷配基在肠道内被吸收，再和糖醛酸结合，进入肝肠循环，再经过多次的肝肠循环，之后，大量的异黄酮苷元在肝脏内与葡萄糖醛酸结合成化合物，这种化合物具有水溶性，被进一步水解，剩余部分则以葡萄糖苷或硫酸酯的形式随尿液排出体外，还可以通过粪便直接被排出体外[17]。另有研究指出，异黄酮还能通过乳汁排出体外。异黄酮在体内的代谢有个体性差异，一般在进入人体后48小时达到药物峰值，在24小时内排出体外，其在体内的吸收及代谢还会受到饮食等其他因素的影响[18]。
综上，大豆作为人们的日常食品，具有较高的营养价值，也具有较高的安全性，近来的流行病学研究结果认为，亚洲国家结肠癌、前列腺癌及乳腺癌的发病率之所以低于西方发达国家，其中一个重要的原因就是和食用豆类食品有关。
随着对大豆磷脂、大豆异黄酮、低聚糖、植物凝血素、蛋白肽、皂苷、甾醇等生物活性物质的深入研究，将会更能发现大豆异黄酮的价值，大豆异黄酮还能作为药物被开发，其市场也将有着巨大的潜力。
参考文献
[1]王春娥，刘叔义.SIF的成分、含量及特性[J].食品科學，1998，19（4）：39-43.
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[5]艾志录，李梦芹，李强，等.功能性成分异黄酮的来源与生理功能[J].2004，（1）：1-6.
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[7]汪玉秀.SIF的研究及应用[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2003，31（10）：113-114.
[8]张玉梅，孙学斌，高旭年，等.紫外分光光度法测定大豆异黄酮含量[J].中国食品卫生杂志，2000，12（4）：7-9.
[9]赵世萍，章育中.葛根中异黄酮含量的薄层光密度法测定[J].药学学报，1985，20（3）：203-208.
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[11]江和源，吕飞杰，台建祥.测定大豆和葛根中异黄酮的高效液相色谱法[J].分析测试学报，2000，19（6）：28-31.
[12]Bannwart C，Fotsis T，Heikkinen R，et al.Identification of the isofla-vonic phytoestrogen daidzein in humanurine.Clin.[J].Chim.Acta，1984，136（2-3）：165-172.
[13]Shihbi Z K，Kute T，Garccia L L，et al.Analysis of is flavones by capillary electrophoresis.J.[J].Chromatography A，1994，680：181-185.
[14]Creeke P I，Wilkinson A P，Lee H A.Development of Elisas for the measurement of the dietary phytoestrogen daidzein and equol in human plasma.[J].Food.Agric.Immunol，1998，10（4）：325-348.
[15]孙克杰，汤坚.异黄酮类化合物在不同氧化体系中的作用研究[J].食品科学，2000，22（3）：22-26.
[16]张玉梅.SIF的生物利用度[J].国外医学.卫生分册，2001，28（2）：104-106.
[17]杨薇.大豆植物性雌激素的构效关系及药理作用[J].中国新药杂志，2001，10（12）：892-896.
[18]谭桂军.SIF与疾病防治[J].天津药学Tianjin Pharmacy，2004，16（2）：64-68.