探讨CD137信号是否通过核因子-κB(NF-κB)调控小鼠血管平滑肌细胞(VSMC)活化T细胞核因子c1(nuclear factor of activated T cells c1，NFATc1)表达。
方法采用组织块贴壁法对正常C57BL/6J小鼠的VSMC进行原代培养。以每孔2×105个VSMC接种于6孔板中培养，待其贴壁后，饥饿24 h，用含10% FBS＋肿瘤坏死因子(TNF-α，终浓度10 ng/ml)的DMEM培养基分别培养细胞0、4、8、12、24、36、48 h后，收获细胞用于CD137 mRNA和蛋白的检测，选取CD137表达最多的时间点进行下一步实验。细胞实验分为3组，即对照组[含10% FBS、TNF-α(终浓度10 ng/ml)、DMEM培养基共同干预]、刺激组[对照组干预基础上加CD137 mAb激动剂(终浓度10 μg/ml)]和抑制组[对照组干预基础上加PDTC (终浓度30 μmol/L)，然后加CD137 mAb激动剂(终浓度10 μg/ml)]。加入不同干预因素后继续培养，分别于90 min时收集核内外磷酸化(p)-NF-κB p65、核因子κB抑制蛋白(IκB-α)，24 h收集细胞总RNA和NFATc1蛋白备检。逆转录定量聚合酶链反应检测CD137和NFATc1 mRNA表达水平。流式细胞术检测CD137膜蛋白表达水平。蛋白印迹法检测IκB-α、NF-κB p65、p-NF-κB p65和NFATc1蛋白表达水平。
结果(1)TNF-α诱导VSMC表达CD137的结果：TNF-α刺激VSMC 4、8、12、24、36、48 h后，细胞CD137 mRNA表达均上调。RT-PCR结果示，以24 h组CD137 mRNA升高最为显著，以未刺激(即0 h)组的细胞为对照进行比较，差异有统计学意义(40.00±2.83比1，P<0.05)。流式细胞术检测亦显示24 h组CD137膜蛋白升高最为显著。(2)各组VSMC中p-NF-κB p65蛋白表达水平的检测结果：刺激组VSMC胞浆中p-NF-κB p65蛋白表达水平高于对照组(8.34±0.28比1，P<0.05)，而IkB-α蛋白表达水平低于对照组(1比2.70±0.28，P<0.05)。抑制组VSMC胞浆中p-NF-κB p65蛋白表达水平低于刺激组(1.15±0.14比8.34±0.28，P<0.05)，而IkB-α蛋白表达水平则高于刺激组(1.78±0.74比1，P<0.05)。刺激组VMSC细胞核内p-NF-κB p65蛋白表达水平高于对照组(2.64±0.42比1，P<0.05)，而抑制组表达水平则低于刺激组(2.09±0.12比2.64±0.42，P<0.05)。(3)各组VSMC中NFATc1 mRNA和蛋白表达水平的检测结果：干预24 h后，刺激组VSMC中NFATc1 mRNA表达水平高于对照组(2.07±0.09比1，P<0.05)，NFATc1蛋白表达水平亦高于对照组(1.75±0.07比1，P<0.05)。而抑制组VSMC中NFATc1 mRNA表达水平低于刺激组(1.15±0.07比2.07±0.09，P<0.05)，蛋白表达水平亦低于刺激组(0.90±0.11比1.75±0.07，P<0.05)。
结论CD137信号通过NF-κB p65影响小鼠VSMC中NFATc1的表达。