【摘 要】
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目的 构建间隙连接蛋白43(Cx43)和绿色荧光蛋白(GFP)双基因共表达重组腺病毒载体.方法 利用PCR方法从真核表达载体pcDNA3.0-Cx43扩增Cx43片断,利用DNA重组技术,将目的基因Cx4
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目的 构建间隙连接蛋白43(Cx43)和绿色荧光蛋白(GFP)双基因共表达重组腺病毒载体.方法 利用PCR方法从真核表达载体pcDNA3.0-Cx43扩增Cx43片断,利用DNA重组技术,将目的基因Cx43克隆至含有报告基因GFP的穿梭质粒pAdTrack-CMV,然后在BJ5183细胞中将重组穿梭质粒pAdTrack-Cx43与pAdeasy-l质粒进行同源重组,产生重组腺病毒载体pAd-Cx43-GFP,用PacⅠ单酶切鉴定重组载体;将pAd-Cx43-GFP转入293细胞中包装,荧光显微镜观察报告基因GFP的表达,Western blot方法检测293细胞中Cx43表达.结果 (1)通过PCR方法从载体pcDNA3.0-Cx43扩增出单一条带,与Cx43片断大小相符;(2)重组穿梭质粒pAdTrack-Cx43经NotⅠ/XhoⅠ双酶切后,电泳可见2个大小约为9、1kb条带,证明pAdTrack-Cx43构建成功;(3)同源重组产物pAd-Cx43-GFP经PacⅠ酶切后,电泳可观察到2个大小约为31、4kb左右条带,与预期结果相符,提示同源重组成功;(4)荧光显微镜下观察可见转染pAd-Cx43-GFP后293细胞在培养1～2d即有绿色荧光表达;(5)利用Western Blot法检测到转染pAd-Cx43-GFP后293细胞中Cx43的表达较未转染组增强.结论 Ad-Cx43-GFP重组腺病毒载体构建成功.
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