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（1.宁夏颅脑疾病重点实验室，宁夏医科大学，宁夏 银川 750004；2.银川市第一人民医院，宁夏 银川 750004）
摘要：目的：研究右美沙芬（DM）对激活的小胶质细胞的作用及热休克蛋白60（HSP60）在DM神经保护中的作用机制。方法：培养BV2小胶质细胞株，分为对照组，细菌脂多糖组，（LPS），实验组（DM）。Western-blot检测DM对LPS激活的BV2细胞HSP60和Caspase 3的影响，ELISA检测DM对HSP60释放的作用。结果：LPS组中HSP60和Caspase 3的表达及释放都比对照组显著增加，加入DM后，这些因子的水平都明显降低。结论：DM可能通过HSP60信号通路途径阻止小胶质细胞的凋亡而发挥神经保护作用。
关键词：热休克蛋白60；右美沙芬；Caspase 3；小胶质细胞
中图分类号：G642.423 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2017）18-0277-02
热休克蛋白是机体的一类应激蛋白，在生理状态下对机体起着保护功能。但是有研究发现，在病理情况下，很多细胞会大量表达热休克蛋白60（HSP60），并将其释放到胞外，引起细胞凋亡[1]。右美沙芬（Dextromethorphan，DM）是一种右旋吗啡喃化合物[2]，对动物因低血糖或脑缺血引起的神经损伤具有保护作用，DM被证明能有效抑制小胶质细胞活化，并且可抑制细胞炎症因子如TNF-α、IL-6，NO和超氧化自由基等[3]，但是右美沙芬的作用机制目前尚不清楚。
一、材料与方法
（一）材料
右美沙芬和LPS购自Sigma公司；HSP60抗体购自ENZO公司；Caspase 3及β-actin抗体购自Cell Signaling公司；蛋白定量BCA试剂盒购自Thermo公司；ELISA试剂盒购自欣博盛公司。
（二）方法
1.小胶质细胞BV2的培養。BV2细胞培养在DEME培养基中，含10%胎牛血清。利用1μg/ml LPS处理30min后，在细胞培养液中加入DM溶液（10μM），作用24小时后收集细胞及上清。
2.Western blot检测蛋白含量。药物处理完毕，提取各实验组的蛋白并收集上清液，10% SDS-PAGE分离后转至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭膜2小时。然后加入一抗，置于4℃过夜。利用TBST洗涤膜三次，洗去未结合的一抗。最后用二抗室温孵育1 h，利用ECL试剂显色成像。
3.ELISA试剂盒检测HSP60的释放。按照HSP60 ELISA试剂盒操作说明进行实验，最后酶标板置于酶标仪上，450nm处测定各孔光密度值（OD）。
4.统计学分析。采用SPSS11.11进行统计学分析。实验数据用x±s表示，组间比较用方差分析，进一步比较两两间差异采用Student-Neuman-Keuls Test方法。
二、结果
（一）DM显著抑制LPS激活的小胶质细胞HSP60的表达及释放
LPS激活后的小胶质细胞中HSP60的表达明显高于对照组，差异具有显著性。加入DM可显著抑制LPS引起的HSP60的升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。对上清液进行ELISA实验，结果显示DM处理后，LPS引起的小胶质细胞HSP60的胞外释放量明显地被抑制了。
（二）DM抑制Caspase 3的表达
Western blot结果表明，LPS激活的小胶质细胞中Caspase 3的表达明显高于对照组，在DM处理的实验组中，Caspase 3的表达显著下降，差别有统计学意义（P<0.05）。
三、讨论
热休克蛋白是一类应激蛋白，对机体主要起着保护作用。但是HSP60对细胞凋亡具有双重作用。我们先前的研究发现心肌细胞中HSP60的表达和定位都发生了改变，导致心肌细胞的损伤或凋亡[4]。但是关于HSP60在神经系统中的作用的报道还很少见。
小胶质细胞的激活参与了多种神经系统退行性病变如老年痴呆症、帕金森症等的发生发展[5]。本研究假设HSP60在激活的小胶质细胞中高度表达，并被释放至胞外。胞外的HSP60激活凋亡因子Caspase 3，导致周围其他神经细胞的损伤或凋亡。本实验证实了在LPS激活的小胶质细胞内HSP60的表达显著增高，胞外也检测到HSP60，并增强了Caspase 3的表达。这些结果与心肌细胞中关于HSP60的研究结果的报道一致，说明小胶质细胞活化后释放至胞外的HSP60可进一步激活自身导致自身的凋亡。
右美沙芬可能是一种潜在的治疗神经系统炎性疾病的药物[6]。本实验中，我们证实了DM能有效抑制小胶质细胞的激活，为一些神经退行性疾病的防治提供了潜在的药物治疗靶点。
参考文献：
[1]Gupta S，Knowlton A A. HSP60，Bax，apoptosis and the heart [R].J Cell Mol Med. 2005，9（1）：51.
[2]Craviso GL and Musacchio JM：High-affinity dextromethorphan binding sites in guinea pig brain. I. Initial characterization [J].Mol Pharmacol. 1983a；23：619–628.
[3]Prince DA and Feeser HR：Dextromethorphan protects against cerebral infarction in a rat model of hypoxia-ischemia [J].Neurosci Lett 1988；85：291-296.
[4]Kim SC，Stice JP，Chen L，Knowlton A A. Extracellular heat shock protein 60，cardiac myocytes，and apoptosis [J].Circ Res，2009；105：1186-1195.
[5]Gonzalez-Scarano F，Baltuch G. Microglia as mediators of inflammatory and degenerative diseases[J].Annu Rev Neurosci，1999；22：219-40.
[6]Mousavi SA，Saadatnia M，Khorvash F，et al：Evaluation of the neuroprotective effect of dextromethorphan in the acute phase of ischaemic stroke [J].Arch Med Sci. 2011；7：465-469.
收稿日期：2016-11-30
基金项目：2016年国家级大学生创新创业训练计划项目（201610752010）
作者简介：王俊燕（1992-），女（汉族），宁夏银川人，宁夏医科大学生物技术专业本科生；李玲（1973-），女（汉族），宁夏银川人，专科，主治医师，银川市第一人民医院高压氧科，主要从事高压氧神经科学研究；张燕（1992-），女，宁夏银川人，宁夏医科大学生物技术专业本科生；
李云鸿（1972-），男（汉族），副教授，硕士，宁夏医科大学，主要从事神经生物学研究。
通讯作者：王银（1973-），女（汉族），教授，博士，硕士生导师，宁夏医科大学，主要从事神经生物学研究。
摘要：目的：研究右美沙芬（DM）对激活的小胶质细胞的作用及热休克蛋白60（HSP60）在DM神经保护中的作用机制。方法：培养BV2小胶质细胞株，分为对照组，细菌脂多糖组，（LPS），实验组（DM）。Western-blot检测DM对LPS激活的BV2细胞HSP60和Caspase 3的影响，ELISA检测DM对HSP60释放的作用。结果：LPS组中HSP60和Caspase 3的表达及释放都比对照组显著增加，加入DM后，这些因子的水平都明显降低。结论：DM可能通过HSP60信号通路途径阻止小胶质细胞的凋亡而发挥神经保护作用。
关键词：热休克蛋白60；右美沙芬；Caspase 3；小胶质细胞
中图分类号：G642.423 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2017）18-0277-02
热休克蛋白是机体的一类应激蛋白，在生理状态下对机体起着保护功能。但是有研究发现，在病理情况下，很多细胞会大量表达热休克蛋白60（HSP60），并将其释放到胞外，引起细胞凋亡[1]。右美沙芬（Dextromethorphan，DM）是一种右旋吗啡喃化合物[2]，对动物因低血糖或脑缺血引起的神经损伤具有保护作用，DM被证明能有效抑制小胶质细胞活化，并且可抑制细胞炎症因子如TNF-α、IL-6，NO和超氧化自由基等[3]，但是右美沙芬的作用机制目前尚不清楚。
一、材料与方法
（一）材料
右美沙芬和LPS购自Sigma公司；HSP60抗体购自ENZO公司；Caspase 3及β-actin抗体购自Cell Signaling公司；蛋白定量BCA试剂盒购自Thermo公司；ELISA试剂盒购自欣博盛公司。
（二）方法
1.小胶质细胞BV2的培養。BV2细胞培养在DEME培养基中，含10%胎牛血清。利用1μg/ml LPS处理30min后，在细胞培养液中加入DM溶液（10μM），作用24小时后收集细胞及上清。
2.Western blot检测蛋白含量。药物处理完毕，提取各实验组的蛋白并收集上清液，10% SDS-PAGE分离后转至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭膜2小时。然后加入一抗，置于4℃过夜。利用TBST洗涤膜三次，洗去未结合的一抗。最后用二抗室温孵育1 h，利用ECL试剂显色成像。
3.ELISA试剂盒检测HSP60的释放。按照HSP60 ELISA试剂盒操作说明进行实验，最后酶标板置于酶标仪上，450nm处测定各孔光密度值（OD）。
4.统计学分析。采用SPSS11.11进行统计学分析。实验数据用x±s表示，组间比较用方差分析，进一步比较两两间差异采用Student-Neuman-Keuls Test方法。
二、结果
（一）DM显著抑制LPS激活的小胶质细胞HSP60的表达及释放
LPS激活后的小胶质细胞中HSP60的表达明显高于对照组，差异具有显著性。加入DM可显著抑制LPS引起的HSP60的升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。对上清液进行ELISA实验，结果显示DM处理后，LPS引起的小胶质细胞HSP60的胞外释放量明显地被抑制了。
（二）DM抑制Caspase 3的表达
Western blot结果表明，LPS激活的小胶质细胞中Caspase 3的表达明显高于对照组，在DM处理的实验组中，Caspase 3的表达显著下降，差别有统计学意义（P<0.05）。
三、讨论
热休克蛋白是一类应激蛋白，对机体主要起着保护作用。但是HSP60对细胞凋亡具有双重作用。我们先前的研究发现心肌细胞中HSP60的表达和定位都发生了改变，导致心肌细胞的损伤或凋亡[4]。但是关于HSP60在神经系统中的作用的报道还很少见。
小胶质细胞的激活参与了多种神经系统退行性病变如老年痴呆症、帕金森症等的发生发展[5]。本研究假设HSP60在激活的小胶质细胞中高度表达，并被释放至胞外。胞外的HSP60激活凋亡因子Caspase 3，导致周围其他神经细胞的损伤或凋亡。本实验证实了在LPS激活的小胶质细胞内HSP60的表达显著增高，胞外也检测到HSP60，并增强了Caspase 3的表达。这些结果与心肌细胞中关于HSP60的研究结果的报道一致，说明小胶质细胞活化后释放至胞外的HSP60可进一步激活自身导致自身的凋亡。
右美沙芬可能是一种潜在的治疗神经系统炎性疾病的药物[6]。本实验中，我们证实了DM能有效抑制小胶质细胞的激活，为一些神经退行性疾病的防治提供了潜在的药物治疗靶点。
参考文献：
[1]Gupta S，Knowlton A A. HSP60，Bax，apoptosis and the heart [R].J Cell Mol Med. 2005，9（1）：51.
[2]Craviso GL and Musacchio JM：High-affinity dextromethorphan binding sites in guinea pig brain. I. Initial characterization [J].Mol Pharmacol. 1983a；23：619–628.
[3]Prince DA and Feeser HR：Dextromethorphan protects against cerebral infarction in a rat model of hypoxia-ischemia [J].Neurosci Lett 1988；85：291-296.
[4]Kim SC，Stice JP，Chen L，Knowlton A A. Extracellular heat shock protein 60，cardiac myocytes，and apoptosis [J].Circ Res，2009；105：1186-1195.
[5]Gonzalez-Scarano F，Baltuch G. Microglia as mediators of inflammatory and degenerative diseases[J].Annu Rev Neurosci，1999；22：219-40.
[6]Mousavi SA，Saadatnia M，Khorvash F，et al：Evaluation of the neuroprotective effect of dextromethorphan in the acute phase of ischaemic stroke [J].Arch Med Sci. 2011；7：465-469.
收稿日期：2016-11-30
基金项目：2016年国家级大学生创新创业训练计划项目（201610752010）
作者简介：王俊燕（1992-），女（汉族），宁夏银川人，宁夏医科大学生物技术专业本科生；李玲（1973-），女（汉族），宁夏银川人，专科，主治医师，银川市第一人民医院高压氧科，主要从事高压氧神经科学研究；张燕（1992-），女，宁夏银川人，宁夏医科大学生物技术专业本科生；
李云鸿（1972-），男（汉族），副教授，硕士，宁夏医科大学，主要从事神经生物学研究。
通讯作者：王银（1973-），女（汉族），教授，博士，硕士生导师，宁夏医科大学，主要从事神经生物学研究。