【摘 要】
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[目的]纯化猪塞尼卡谷病毒(Seneca Valley virus,SVV)SVV-CH-HB2016毒株,并制备其结构蛋白VP1、VP2和VP3的单克隆抗体.[方法]以蔗糖密度梯度离心法纯化的SVV-CH-HB2016病毒颗粒作为抗原,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行细胞融合.通过间接免疫荧光试验(IFA)结合间接ELISA筛选阳性细胞株,制备能特异性分泌针对结构蛋白的杂交瘤细胞株.采用Western blotting和IFA方法分别检测单克隆抗体与重组表达蛋白及天然结构蛋白
【机 构】
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华中农业大学,农业微生物学国家重点实验室,武汉430070;广西农业职业技术大学,南宁530007;华中农业大学,农业微生物学国家重点实验室,武汉430070
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[目的]纯化猪塞尼卡谷病毒(Seneca Valley virus,SVV)SVV-CH-HB2016毒株,并制备其结构蛋白VP1、VP2和VP3的单克隆抗体.[方法]以蔗糖密度梯度离心法纯化的SVV-CH-HB2016病毒颗粒作为抗原,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行细胞融合.通过间接免疫荧光试验(IFA)结合间接ELISA筛选阳性细胞株,制备能特异性分泌针对结构蛋白的杂交瘤细胞株.采用Western blotting和IFA方法分别检测单克隆抗体与重组表达蛋白及天然结构蛋白的反应性,并对单克隆抗体的病毒中和保护效果进行测定.利用空斑试验和实时荧光定量PCR方法探究中和性单克隆抗体对SVV-CH-HB2016毒株吸附过程的影响,最后用抗体相加试验来分析14株单克隆抗体的抗原表位.[结果]在蔗糖密度梯度为5％～45％(W/V)时获得了纯度较好、浓度较高的SVV-CH-HB2016毒株结构蛋白,免疫小鼠血清抗体效价均达到了 1 ∶ 12 800,成功制备了 17株能稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株.经验证14株单克隆抗体能与重组结构蛋白发生Western blotting反应,17株单克隆抗体能与病毒发生1FA作用;2G6、4A3和4C11 3株单克隆抗体对SVV-CH-HB2016毒株感染的BHK-21细胞具有明显中和保护作用,也能有效抑制SVV-CH-HB2016毒株对293T细胞的吸附.经分析发现,除1F5与2E1、4B8与4F11外,其余10株单克隆抗体分别针对不同抗原表位.[结论]本研究初步建立了 SVV的纯化方法,制备了 17株特异性针对SVV-CH-HB2016毒株的单克隆抗体,为后期进一步开展SVV全病毒灭活疫苗的研发、ELISA检测方法的建立及保护性抗原表位的鉴定奠定了基础.
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