【摘 要】
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目的 探讨小干扰RNA( siRNA)对体外人CD4+ CD25-T淋巴细胞MLL1基因表达的抑制效果及体外转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导调节性T淋巴细胞(iTreg)的影响,为治疗与Treg失衡相关
【机 构】
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徐州医学院研究生学院,江苏徐州,221003徐州医学院附属连云港市第一人民医院儿科,江苏连云港,222002;
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目的 探讨小干扰RNA( siRNA)对体外人CD4+ CD25-T淋巴细胞MLL1基因表达的抑制效果及体外转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导调节性T淋巴细胞(iTreg)的影响,为治疗与Treg失衡相关的临床疾病提供理论基础.方法 采用免疫磁珠分选方法从健康人外周血中分离出CD4+ CD25-T淋巴细胞(纯度＞85％).MLL1基因的SET区对组蛋白3上的第4个赖氨酸位点的甲基化起重要作用,针对其设计并合成了不同的siRNAs,分别为带绿色荧光的siRNA( siRNA-FAM)、3个实验组(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3)与1个阴性对照组(siRNA-NC).采用脂质体法转染分选后培养24h的人CD4+ CD25-T淋巴细胞.先转染siRNA-FAM,于转染后的6h,用荧光显微镜观察siRNA的转染效率,寻找最佳的转染条件.按照上述转染条件转染siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-NC.于转染后的48 h,每组取2×106个细胞,提取细胞内RNA,然后反转录为cDNA,用聚合酶链反应扩增该片段,用琼脂糖凝胶检测扩增后的DNA.在MLL1基因表达受到抑制的情况下,采用流式细胞术检测TGF-β1诱导72 h iTreg的比例.结果 当siRNA为100 pmol,脂质体为5×10-6L时,siRNA的转染效率最高为(50.80 ±0.61)％.该实验条件下,发现实验组siRNA-2对MLL1基因mRNA较对照组有明显削弱作用(F=5.820,P＜0.05).在MLL1基因表达削弱的情况下,TGF-β1诱导72 h iTreg比例有明显降低(F=4.046,P＜0.05).结论 siRNA可以有效抑制人CD4+ CD25-T淋巴细胞中MLL1基因的表达,找到了具有较高转染效率的siRNA.TGF-β1体外诱导的iTreg受核因子MLL1的调节.
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