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摘 要：复方氨基酸注射液可提供完全、平衡的18种必需和非必需氨基酸，改善氮平衡，促进人体蛋白质代谢正常，纠正负氮平衡，补充蛋白质，加快伤口愈合的作用。本文采用高校液相测定了复方氨基酸注射液中酪氨酸和色氨酸的含量，固定相为：奥泰公司C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），乙腈-甲醇-20mmol/L磷酸二氢钠溶液（磷酸调pH3.5±0.1）（5：5：90）为流动相，检测波长为280nm；此方法简便、准确、重现性好，可用于复方氨基酸注射液中色氨酸和酪氨酸的含量测定。
关键词：复方氨基酸注射液；色氨酸；含量
复方氨基酸注射液具有改善氮平衡，促进人体蛋白质代谢正常，纠正负氮平衡，补充蛋白质，加快伤口愈合的作用。酪氨酸（英语：Tyrosine）简写为Tyr或Y，是一种芳香族氨基酸，亦是20种用来合成蛋白质的蛋白氨基酸之一，它属于非必须氨基酸。色氨酸是重要的营养剂，可参与动物体内血浆蛋白质的更新，并可促使核黄素发挥作用，还有助于烟酸及血红素的合成[1-10]。色氨酸作为一种必须氨基酸，广泛应用于医药、食品及饲料等方面。本文采用高校液相测定了复方氨基酸注射液中酪氨酸和色氨酸的含量。
1 仪器与试药
Waters510高效液相色谱仪；N2000色谱工作站；B03001-004在线脱气机（上海笛柏实验设备有限公司）；Waters2487可变波长检测器。WaterPro 超纯水系统（照生有限公司）；SK3300HP功率可调台式超声器（上海垒固仪器有限公司）；DKB-501S超级恒温水槽（杭州诺丁科学器材有限公司）；R-1001-VN旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）；万分之一分析天平赛多利斯BSA224S（立特电子科技（香港）有限公司）；SHB-III 循环水真空泵（西安中诺仪器有限公司）；TU-1901 双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。乙腈（启东市名成化工有限公司）、三乙胺（连云港市通源化工有限公司）、冰醋酸（宁阳县汇金化工科技有限公司）、甲醇（启东市名成化工有限公司）、醋酸钠（宁阳县汇金化工科技有限公司）、磷酸二氢钠（宁阳县汇金化工科技有限公司）、四氢呋喃（连云港市通源化工有限公司）、磷酸（淄博天智化工有限公司）。
2 含量测定
2.1 色谱条件：依据查阅文献及考查的结果[11-14]，确定色谱条件如下。色谱柱为奥泰公司 C18色谱柱（250 mm×4.6mm，5μm）；乙腈-甲醇-20mmol/L磷酸二氢钠溶液（磷酸调pH 3.5±0.1）（5：5：90）为流动相；检测波长为280nm；流速1.0mL·min-1；柱温：30℃。理论板数按色氨酸峰计算应不得低于2500。
2.2 供试品溶液的制备。精密量取复方氨基酸注射液适量，置于容量瓶内，加水適量，超声处理五分钟，加水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，即得。
2.3 对照品溶液的制备。精密称取酪氨酸和色氨酸对照品适量，置容量瓶中，加水制成每1mL含酪氨酸100μg和色氨酸1mg的溶液，即得。
2.4 标准曲线的制备。分别精密称取色氨酸对照品、酪氨酸对照品100.0mg、10.0mg，置50ml容量瓶中，加入水使溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取1、2、4、6、8mL，置于10mL量瓶中，加水至刻度，摇匀。分别精密上述溶液吸取10μL，注人液相色谱仪，依照2.1项下的色谱条件测定，记录色谱峰。以峰面积（Y）为纵坐标，对照品进样量（X）为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。结果表明，色氨酸在0.2～2.0mμg·mL-1范围内呈良好的线性关系；酪氨酸在20～200μg·mL-1范围内呈良好的线性关系。
2.5 精密度试验。依照2.3项下制备对照品溶液，分别精密吸取色氨酸和酪氨酸对照品溶液重复测定6次，测定峰面积积分值，对照品峰面积积分值的RSD分别为0.63%和0.81%。结果表明，本实验精密度良好。
2.6 专属性试验。依照处方取除色氨酸和酪氨酸以外的原辅料，按样品制备工艺制成阴性对照样品，照2.3项下供试品溶液的制备方法制成阴性液，依上述方法测定，结果在色氨酸和酪氨酸出峰处阴性液无色谱峰，结果阴性试验没有干扰，表明本方法专属性良好。
2.7 稳定性试验。依照2.3项下供试品制备方法制备供试品溶液，分别在0，2，4，8小时进样测定，供试品色氨酸和酪氨酸峰面积的RSD分别为0.73%和0.81%。结果表明色氨酸和酪氨酸至少在8小时内稳定。
2.8 回收率试验。精密称取已知含量的样品6份，分别加入一定量的色氨酸和酪氨酸对照品，按供试品制备所述方法制备供试品溶液，测定含量，计算回收率。6次测定的平均回收率分别为99.2%和99.3%，RSD分别为0.88%和0.79%。
2.9 样品含量测定。依照上述含量测定方法，测定复方氨基酸注射液三批样品中色氨酸和酪氨酸的含量，结果三批样品的色氨酸和酪氨酸含量分别为标示量的100.1%、100.2%、100.1%和100.1%、99.9%、99.6%。
3 讨论
分别考察乙腈-甲醇-20mmol/L磷酸二氢钠溶液（磷酸调pH 3.5±0.1）（5：5：90），乙腈-甲醇-20mmol/L磷酸二氢钠溶液（磷酸调pH 3.5±0.1）（10：5：85），甲醇-水-冰醋酸（33∶66∶1），乙腈-0.01mol/L磷酸二氢钾（三乙胺调pH=6.5）（55：45），甲醇-水-三乙胺（40∶60：0.1），甲醇-水-冰醋酸（46∶43∶1），乙腈-0.01mol/L的磷酸氢二钠-磷酸（20：80：0.01）不同比例的流动相，结果以乙腈-甲醇-20mmol/L磷酸二氢钠溶液（磷酸调pH 3.5±0.1）（5：5：90）为流动相，供试品各峰分离效果最好，故选用乙腈-甲醇-20mmol/L磷酸二氢钠溶液（磷酸调pH 3.5±0.1）（5：5：90）为流动相。复方氨基酸注射液中色氨酸和酪氨酸的含量为标示量的95%-105%。
参考文献
[1]焦庆才，赵根海，刘均忠，刘茜.L-色氨酸工业化技术研究进展[J].发酵科技通讯，2010（4）.
[2]胡耀辉，王玉华，于寒松，刘俊梅.L-色氨酸的应用及生产技术研究进展[J].吉林农业大学学报，2008（4）.
[3]刘贤雪，雷建湘，郭跃平，汪钊.谷氨酸、色氨酸、丝氨酸发酵进展[J].发酵科技通讯，2009（3）.
[4]翁辉廉，周路德.L-色氨酸的临床应用[J].广州医药，1990（3）.
[5]胡耀辉，王玉华，于寒松，刘俊梅.L-色氨酸的应用及生产技术研究进展[J].吉林农业大学学报，2008（4）.
[6]赵春光，程立坤，徐庆阳，陈宁，谢希贤.微生物法生产L-色氨酸的研究进展[J].发酵科技通讯，2008（4）.
[7]杨会琴.L-色氨酸生物技术研究进展[J].食品科学，2007（9）.
[8]李剑欣，张绪梅，徐琪寿.色氨酸的生理生化作用及其应用[J].氨基酸和生物资源，2005（3）.
[9]宋文霞，王瑞明.L-色氨酸的研究[J].农产品加工（学刊），2005（3）.
[10]桑丽花，王玉梅，潘成文，齐飞.L-色氨酸的应用[J].河北化工，2009（10）.
[11]张丹，陈红.HPLC法测定甘氨酰-L-酪氨酸含量及其有关物质[J].药物分析杂志，2006（5）.
[12]陈永波，饶斌，覃兰.高效液相色谱法快速直接测定酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸[J].氨基酸和生物资源，2000（1）.
[13]洪敏，唐爱国.高效液相色谱-荧光法测定血清苯丙氨酸和酪氨酸[J].中南大学学报（医学版），2004（1）.
[14]高丽红，赵平，柴逸峰，刘荔荔，吴玉田.HPLC（CMPA）法分析苯丙氨酸对映体的研究[J].第二军医大学学报，2001（11）.
关键词：复方氨基酸注射液；色氨酸；含量
复方氨基酸注射液具有改善氮平衡，促进人体蛋白质代谢正常，纠正负氮平衡，补充蛋白质，加快伤口愈合的作用。酪氨酸（英语：Tyrosine）简写为Tyr或Y，是一种芳香族氨基酸，亦是20种用来合成蛋白质的蛋白氨基酸之一，它属于非必须氨基酸。色氨酸是重要的营养剂，可参与动物体内血浆蛋白质的更新，并可促使核黄素发挥作用，还有助于烟酸及血红素的合成[1-10]。色氨酸作为一种必须氨基酸，广泛应用于医药、食品及饲料等方面。本文采用高校液相测定了复方氨基酸注射液中酪氨酸和色氨酸的含量。
1 仪器与试药
Waters510高效液相色谱仪；N2000色谱工作站；B03001-004在线脱气机（上海笛柏实验设备有限公司）；Waters2487可变波长检测器。WaterPro 超纯水系统（照生有限公司）；SK3300HP功率可调台式超声器（上海垒固仪器有限公司）；DKB-501S超级恒温水槽（杭州诺丁科学器材有限公司）；R-1001-VN旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）；万分之一分析天平赛多利斯BSA224S（立特电子科技（香港）有限公司）；SHB-III 循环水真空泵（西安中诺仪器有限公司）；TU-1901 双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。乙腈（启东市名成化工有限公司）、三乙胺（连云港市通源化工有限公司）、冰醋酸（宁阳县汇金化工科技有限公司）、甲醇（启东市名成化工有限公司）、醋酸钠（宁阳县汇金化工科技有限公司）、磷酸二氢钠（宁阳县汇金化工科技有限公司）、四氢呋喃（连云港市通源化工有限公司）、磷酸（淄博天智化工有限公司）。
2 含量测定
2.1 色谱条件：依据查阅文献及考查的结果[11-14]，确定色谱条件如下。色谱柱为奥泰公司 C18色谱柱（250 mm×4.6mm，5μm）；乙腈-甲醇-20mmol/L磷酸二氢钠溶液（磷酸调pH 3.5±0.1）（5：5：90）为流动相；检测波长为280nm；流速1.0mL·min-1；柱温：30℃。理论板数按色氨酸峰计算应不得低于2500。
2.2 供试品溶液的制备。精密量取复方氨基酸注射液适量，置于容量瓶内，加水適量，超声处理五分钟，加水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，即得。
2.3 对照品溶液的制备。精密称取酪氨酸和色氨酸对照品适量，置容量瓶中，加水制成每1mL含酪氨酸100μg和色氨酸1mg的溶液，即得。
2.4 标准曲线的制备。分别精密称取色氨酸对照品、酪氨酸对照品100.0mg、10.0mg，置50ml容量瓶中，加入水使溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取1、2、4、6、8mL，置于10mL量瓶中，加水至刻度，摇匀。分别精密上述溶液吸取10μL，注人液相色谱仪，依照2.1项下的色谱条件测定，记录色谱峰。以峰面积（Y）为纵坐标，对照品进样量（X）为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。结果表明，色氨酸在0.2～2.0mμg·mL-1范围内呈良好的线性关系；酪氨酸在20～200μg·mL-1范围内呈良好的线性关系。
2.5 精密度试验。依照2.3项下制备对照品溶液，分别精密吸取色氨酸和酪氨酸对照品溶液重复测定6次，测定峰面积积分值，对照品峰面积积分值的RSD分别为0.63%和0.81%。结果表明，本实验精密度良好。
2.6 专属性试验。依照处方取除色氨酸和酪氨酸以外的原辅料，按样品制备工艺制成阴性对照样品，照2.3项下供试品溶液的制备方法制成阴性液，依上述方法测定，结果在色氨酸和酪氨酸出峰处阴性液无色谱峰，结果阴性试验没有干扰，表明本方法专属性良好。
2.7 稳定性试验。依照2.3项下供试品制备方法制备供试品溶液，分别在0，2，4，8小时进样测定，供试品色氨酸和酪氨酸峰面积的RSD分别为0.73%和0.81%。结果表明色氨酸和酪氨酸至少在8小时内稳定。
2.8 回收率试验。精密称取已知含量的样品6份，分别加入一定量的色氨酸和酪氨酸对照品，按供试品制备所述方法制备供试品溶液，测定含量，计算回收率。6次测定的平均回收率分别为99.2%和99.3%，RSD分别为0.88%和0.79%。
2.9 样品含量测定。依照上述含量测定方法，测定复方氨基酸注射液三批样品中色氨酸和酪氨酸的含量，结果三批样品的色氨酸和酪氨酸含量分别为标示量的100.1%、100.2%、100.1%和100.1%、99.9%、99.6%。
3 讨论
分别考察乙腈-甲醇-20mmol/L磷酸二氢钠溶液（磷酸调pH 3.5±0.1）（5：5：90），乙腈-甲醇-20mmol/L磷酸二氢钠溶液（磷酸调pH 3.5±0.1）（10：5：85），甲醇-水-冰醋酸（33∶66∶1），乙腈-0.01mol/L磷酸二氢钾（三乙胺调pH=6.5）（55：45），甲醇-水-三乙胺（40∶60：0.1），甲醇-水-冰醋酸（46∶43∶1），乙腈-0.01mol/L的磷酸氢二钠-磷酸（20：80：0.01）不同比例的流动相，结果以乙腈-甲醇-20mmol/L磷酸二氢钠溶液（磷酸调pH 3.5±0.1）（5：5：90）为流动相，供试品各峰分离效果最好，故选用乙腈-甲醇-20mmol/L磷酸二氢钠溶液（磷酸调pH 3.5±0.1）（5：5：90）为流动相。复方氨基酸注射液中色氨酸和酪氨酸的含量为标示量的95%-105%。
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[8]李剑欣，张绪梅，徐琪寿.色氨酸的生理生化作用及其应用[J].氨基酸和生物资源，2005（3）.
[9]宋文霞，王瑞明.L-色氨酸的研究[J].农产品加工（学刊），2005（3）.
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