PCR法分子克隆及序列分析广西产眼镜王蛇蛇毒a-神经毒素基因

• 作 者: 李其斌 渡庆次贺博 金城记代彦 中村真理子 小杉忠诚
• 机 构: 中国广西医科大学第一附属医院急诊科蛇伤与中毒研究中心，中国南宁530027,日本琉球大学医学部第一分子生理学,日本琉球大学医学部第一分子生理学,日本琉球大学医学部第一分子生理学,日本琉球大学医学部第一
• 出 处: 中华急诊医学杂志
• 发表日期: 2004年13期

目的 为了获得眼镜王蛇(ophiophagus hannah，Oh)蛇毒a-神经毒素(a-Neurotoxin．a-NT)的基因序列。方法 我们通过比较了基因库中已知眼镜蛇科不同种类毒蛇来源的a-NT基因，发现它们有较高的同源性，特别是5’和3’非翻译区及引导肽部分高度保守，据此设计了包括翻译起始点的上游引物，以及为了得到3’端较完整非编码部分而设计了基本上属于d(T)的反意链下游RACE-PCR引物。为了克服引物所带来的模糊扩增，还在蛋白编码部分再设计一对上下游引物，由此组成P1、P2、P3和P4四对引物。采用Nacleospin RNA Kit法分别从3条活Oh蛇毒腺中提取mRNA，以3’端引物合成eDNA的第一链，并以此作为模板，分别用四对引物进行PCR扩增反应，得到了目的基因不同长度的PCR产物，产物经精制后进行测序，对比分析其结果。结果 获得了全长474bp的Oh．eDNA的基因核苷酸序列，包括5’端60bp，信号肽伴启动子ATG63bp，蛋白质密码部分216bp和3’端186bp并含有TGA终止码。经基因库信息计算机分析其信号肽与眼镜蛇树属(Pseudonnaja textilis，Pt．)海蛇(Laticauda semufasciata，Ls)100％同源，96.8％与眼镜蛇南洋亚种(Naja sputatrix，Ns)和银环蛇(Bungarus multicinctus，Bm)同源．蛋白密码部分83.3％与Ns，79.2％与Pt，76.4％与Ls和74.1％与Bm同源．氨基酸顺序分析信号肽后紧接着的72个氨基酸90.3％与已发现的眼镜王蛇毒长链a—NT’toxina同源，大约73．6％Toxinb、69．7％Oh-4、66.7％Oh-5、56.9％Oh-6A和6B同源，并与a-银环蛇毒素54.2％同源。结论 新发现的Oh-eDNA属于长链a-NT的基因。