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摘 要： 以藥食两用植物绞股蓝为材料，研究了植物激素乙烯对绞股蓝皂苷生物合成关键酶基因表达及皂苷含量的影响。该文采用荧光定量PCR技术，检测了乙烯利处理后绞股蓝不同器官中皂苷生物合成关键酶基因GpFPS、GpSS和GpSE的表达水平;采用分光光度法及HPLC技术，测定了乙烯利处理对绞股蓝总皂苷和皂苷单体Rb1、Rb3和Rd含量的影响。结果表明：（1）外施乙烯利能够不同程度地上调GpFPS、GpSS和GpSE基因的表达水平，且3个基因的表达模式在不同器官间不同，而在同一器官中相似。（2）在乙烯利处理后3 d，所测各器官中的总皂苷含量与对照相比均有所上升，其中根、成熟叶和幼叶达到显著水平，但3个皂苷单体在不同器官中的增加或降低并不一致，以Rb3含量最高。该结果为探索利用植物激素调控绞股蓝皂苷次生代谢提供了参考。
关键词： 绞股蓝， 乙烯， 皂苷， 基因表达， 植物器官
中图分类号： Q943
文献标识码： A
文章编号： 1000-3142（2021）06-1014-07
收稿日期： 2020-02-07
基金项目： 国家自然科学基金（31760044， 31260039） [Supported by the National Natural Science Foundation of China （31760044， 31260039）]。
作者简介： 王婷（1992-），硕士研究生，研究方向为植物生态学，（E-mail）1690383633@qq.com。
*通信作者： 刘世彪，博士，教授，研究方向为发育植物学和植物资源学，（E-mail）liushibiao_1@163.com。
*共同通信作者： 田维敏，博士，教授/研究员，研究方向为橡胶树发育生物学，（E-mail）wmtian@163.com。
Effects of ethylene on gypenoside biosynthesis-related key enzyme gene expression and gypenoside content in Gynostemma pentaphyllum
WANG Ting1，2， ZHANG Shixin2， PAN Fengliu1， PENG Xiaolie1， TIAN Weimin2*， LIU Shibiao1*
（ 1. College of Biology and Environmental Science， Jishou University， Jishou 416000， Hunan， China; 2. Rubber Research Institute， Chinese Acadeny of Tropical Agricultural Sciences， Danzhou 571737， Hainan， China ）
Abstract： The effects of plant hormone ethylene on gypenoside biosynthesis-related key enzyme gene expression and gypenoside content in medicine-food plant Gynostemma pentaphyllum were analyzed in this study. Fluorescence quantitative PCR was employed to test the expression levels of GpFPS， GpSS and GpSE， key enzyme genes in saponin biosynthesis pathway in different organs of G. pentaphyllum treated with ethephon， while spectrophotometry and HPLC were used to assay the contents of total gypenoside and saponin monomer Rb1， Rb3 and Rd in G. pentaphyllum. The results were as follows： （1） The expression levels of GpFPS， GpSS and GpSE genes were up-regulated by addition of ethephon in different extents， and the expression patterns of these three genes were dissimilar in different organs， but similar in the same organ. （2） The contents of total gypenoside in all organs increased when compared with the control， and those in root， mature leaf and young leaf arrived at significant level 3 d after ethephon treatment; However， the three saponin monomers increased or decreased in organs were inconsistency， with Rb3 had the highest content. The results provide reference for the research of using plant hormone to regulate the secondary metabolism in G. pentaphyllum. Key words： Gynostemma pentaphyllum， ethylene， gypenoside， gene expression， plant organ
绞股蓝（Gynostemma pentaphyllum）又名五叶参、七叶参、七叶参胆、小苦草、遍地生根等，为葫芦科（Cucurbitaceae）绞股蓝属（Gynostemma Blume）的多年生草质藤本植物。绞股蓝可制成保健茶，也可作为野菜食用，入药则具有降血压、降血脂、助消化、延缓衰老、调节神经系统和免疫功能的作用，属于重要的药食两用植物（Yan et al.， 2014;彭小列等，2017;Wang et al.， 2018）。绞股蓝体内的主要药用成分为绞股蓝皂苷（gypenoside），现已分离得到结构明确的绞股蓝皂苷201种（范冬冬等，2017）。绞股蓝皂苷在结构上和人参皂苷类似，绞股蓝皂苷3、4、8分别与人参皂苷Rb1、Rb3、Rd 结构相同，其生物合成途径也与人参相同。
人参皂苷属于四环三萜类化合物，是类异戊二烯代谢途径中三萜类合成支路的产物，其生物合成分为三个阶段。第一阶段：通过甲羟戊酸途径（mevalonate pathway，MVA）和2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸途径（methylery-thritol phosphate pathway，MEP），合成主要的中间产物异戊烯基焦磷酸（isopentenyldiphosphate，IPP）與二甲烯丙基二磷酸（dimethylallyl diphos-phate，DMAPP）。第二阶段：IPP和DMAPP被牻牛儿基焦磷酸合成酶（geranylgeranyl pyrophosphate synthase，GPS）、法呢基焦磷酸合成酶（farnesyl diphosphate synthase，FPS）、鲨烯合成酶（squalene synthase，SS）和鲨烯环氧酶（squalene epoxidase，SE）催化合成 2，3-氧化鲨烯。第三阶段：2，3-氧化鲨烯经过环化、羟基化、糖基化等过程后，最终形成Rb1、Rb3、Rd等不同类型的人参皂苷（赵灿等，2015;林彦萍，2016）。
乙烯（ethylene，ET）是一种植物内源激素，能够广泛调控植物生长发育、抵抗逆境及次生代谢产物合成等生理活动（Zhao et al.， 2005;方俊华等，2014）。乙烯已用于提高具有一定药用价值的植物次生代谢产物产量，如用乙烯利刺激檀香植株，能够增加檀香叶中总黄酮的含量（文海涛等，2010），在红豆杉细胞培养中添加0.018 mL·L-1的乙烯可大幅度提高紫杉烷的产量（Pan et al.， 2000）。在对五加科植物人参的研究中已有报道，乙烯可以作为信号分子调节人参的生长发育和人参皂苷的积累（Bae et al.， 2006）。乙烯对皂苷积累的影响与其对鲨烯合成酶和鲨烯环氧酶基因基因表达的诱导有直接的关系，如用乙烯前体 1- 氨基环丙烷羧酸（ACC）处理人参培养细胞可以诱导鲨烯合成酶和鲨烯环氧酶基因的转录表达，并能导致皂苷含量的上升（Xu et al.， 2005）。因此，可以确认乙烯对人参皂苷类生物合成具有必然的影响。然而，其影响机制尚不明确（Rahimi et al.， 2015）。绞股蓝是除五加科以外唯一的含有人参皂苷的植物，被誉为“南方人参”。植物激素乙烯对绞股蓝的影响是否与对人参的影响模式相类似，目前尚未见报道。本文研究了外源乙烯利（一种乙烯释放剂）对绞股蓝皂苷生物合成关键酶FPS、SS和SE的基因表达、绞股蓝总皂苷及皂苷单体Rb1、Rb3和Rd含量的调控作用，旨在探讨乙烯对绞股蓝皂苷类物质合成积累的影响机制，为发展绞股蓝的高效栽培技术提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
所用材料为扦插扩繁的绞股蓝植株，种植在人工培养室中，温度25 ℃，相对湿度60%，12 h光照，光照强度40 μmol·m-2·s-1，培养40 d。实验处理时插口虽有须根生长，但无根状茎发育。选取长势一致且长出10～12片新叶的植株，以0.5%乙烯利喷施叶面至溶液即将流出叶片为准，对照植株喷施超纯水（CK）。分别在乙烯利处理后的2 h、6 h和3 d取样，在每个时间点分别取5株的幼叶、成熟叶、茎和根。用于PCR分析的材料立即投入液氮中备用;用于皂苷含量测定的材料在60 ℃烘箱中烘干24 h至衡重，干燥器中保存备用。每个处理取3次生物学重复。
1.2 方法
1.2.1 总RNA的提取与cDNA的合成 RNA prep Pure Plant Kit [天根生化科技（北京）有限公司，DP441]试剂盒说明，提取绞股蓝各组织的总RNA，使用DNase Ⅰ去除RNA样品中的微量DNA。采用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Fisher Scientific Inc.，K1662），按照1 μg的总RNA量，进行等量反转录合成cDNA。
1.2.2 荧光定量PCR分析 在NCBI数据库中搜索本研究的绞股蓝各基因的序列，使用primer premier 6.0软件设计基因的荧光定量PCR引物序列如表1。
荧光定量反应体系为10 μL，其中包括2×SYBR Premix 5 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL （引物浓度为10 μmol·L-1，反应体系中每条引物终浓度均为0.2 μmol·L-1）、cDNA模板2 μL、ddH 2 O2 2 μL。qPCR反应在Bio-Rad公司的CFX实时荧光定量PCR仪中进行，按仪器使用说明书进行操作，qPCR反应程序：95 ℃预变性3 min;95 ℃变性10 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，共40个循环;然后进行溶解曲线分析。利用CFX manager 3.0软件自动进行基线和Cq值分析。根据Q=2-△△Cq计算基因的表达值。 1.2.3 总皂苷与皂苷单体的测定
1.2.3.1 总皂苷的测定 参考宋小妹等（1998）的方法，采用超声波提取法提取粗总皂苷，用色谱甲醇溶解烘干的粗总皂苷，定容至10 mL，即制成总皂苷样品溶液;采用比色法测定总皂苷含量，以购置于中国药品生物制品鉴定所的绞股蓝总皂苷（≥98%）为标准品，在波长550 nm处测定吸光度。以吸光度（A）为纵坐标Y，浓度（C）为横坐标X进行线性回归，得到回归方程。Y=1.559 6X-0.066 2 （R2=0.998 8）。将制备好的总皂苷样品溶液按上述方法进行检测，所得数据按标准曲线方程换算成总皂苷含量。
1.2.3.2 皂苷单体的测定 参考史美荣等（2015）的高效液相色谱法测定皂苷单体。绞股蓝皂苷单体标准品（≥98%）用孔径为0.22 μm的滤膜进行过滤，注入进样小瓶中。使用安捷伦（Agilent Technologies）的高效液相色谱仪进样进行HPLC检测，检测的条件如表2所示。根据已有的高效液相色谱条件测定峰面积，由已知的浓度和得出的峰面积进行方程计算，以浓度X为横坐标，峰面积Y为纵坐标绘标准曲线，得出直线回归方程如下。Rb1：Y=22.726X-99.254 （R2=0.918 2）;Rb3：Y=45.997X-33.976 （R2=0.999 2）;Rd：Y=44.715X-65.191 （R2=0.999 5）。将制备好的皂苷样品溶液按上述方法检测，所得数据按标准曲线方程换算成皂苷单体含量。
1.2.4 數据处理分析 用Excel 2007软件整理数据，处理组和对照组之间的差异显著性分析用SPSS 20.0软件进行单因素AVONA检验。*表示差异显著（P<0.05），**表示差异极显著（P<0.01）。
2 结果与分析
2.1 乙烯对绞股蓝皂苷生物合成关键酶FPS、SS和SE基因表达的影响
乙烯对绞股蓝根、茎、成熟叶和幼叶中的皂苷生物合成关键酶FPS、SS和SE基因表达的影响如图1所示。在根中，GpFPS呈明显上调表达，且2 h和6 h的表达量显著高于对照，6 h的表达量最大，至处理后3 d时与对照无显著差异;根中的GpSS在6 h时的表达量显著高于对照，而2 h和3 d的表达量与对照没有显著差异;根中的GpSE在处理后2 h和6 h的表达量显著升高，3 d时与对照无差异。在茎中，GpFPS呈极显著上调表达，2 h表达量最大，随后表达量虽逐渐降低，但均高于对照;茎中的GpSS在处理后2 h的表达量最大，显著高于对照，6 h时与对照相似，到3 d时又显著上调;茎中的GpSE在处理后2 h即达最高值，显著高于对照，其后两阶段急剧下降至对照水平。在成熟叶中，GpFPS在2 h时与对照水平相当，到6 h和3 d显著上调表达，3 d表达量达到最大值;GpSS的表达量在2 h时显著低于对照，到6 h时已恢复到对照水平，3 d时呈显著上调表达;GpSE的表达水平则呈连续的显著上升趋势，至3 d时达最高。在幼叶中，GpFPS的表达量呈明显的连续降低模式，2 h和6 h显著高于对照，3 d时显著低于对照;GpSS在2 h时的表达量显著高于对照，6 h时与对照无显著差异，3 d时有显著上升;GpSE在2 h和6 h的表达量显著高于对照，以6 h最高，在3 d时降至对照水平。在根、茎和成熟叶三个器官中，GpSE的表达模式与GpFPS的表达模式大致相似，在茎和幼叶中，GpFPS和GpSS的表达模式大致相似。
总体来看，这3个基因在同一器官中响应乙烯利的表达模式相似。乙烯利处理后，在根中，GpFPS、GpSS和GpSE均是在6 h时显著高于对照且表达量最大;在茎中，它们的表达量在2 h均达到最大值，且显著高于对照;在成熟叶中，这3个基因对乙烯利的响应表现为持续上调表达，在处理后3 d的表达量均达到最大值，且显著高于对照;在幼叶中，3个基因在乙烯利处理2 h的表达量均显著高于对照。
2.2 乙烯对不同器官总皂苷和皂苷单体含量的影响
乙烯利处理3 d时的绞股蓝总皂苷和3种皂苷单体的含量如图2所示。处理植株的根、茎、成熟叶和幼叶的总皂苷含量平均值分别为15.33、75.23、69.64和110.67（mg·g-1FW）。对照植株的根、茎、成熟叶和幼叶的总皂苷含量平均值分别为7.84、61.75、37.53和80.67（mg·g-1FW）。差异显著性分析表明，处理植株的根、茎、成熟叶和幼叶的总皂苷含量均高于对照，其中根、成熟叶和幼叶达到显著水平，而茎与对照差异不显著。
乙烯利处理下绞股蓝3种皂苷单体的含量各不相同，其变化也不同于总皂苷含量。差异显著性分析表明，茎的Rb1含量显著高于对照，成熟叶和幼叶含量高于对照，根的含量低于对照，它们均未达到显著水平;根和茎的Rb3含量显著高于对照，成熟叶和幼叶的Rb3含量低于对照，没有显著差异;Rd在成熟叶中的含量显著低于对照，在根、茎和幼叶中与对照没有显著差异。总体来看，3种单体在植株中的分布具有器官特异性，且Rb3的含量高于其他2个单体。
3 讨论与结论
植物激素可调控植物体内次生代谢产物的合成，乙烯也不例外，作为唯一的气态植物激素，它不仅是环境变化和植物发育、适应的桥梁（张睿等，2020），而且常被作为外源激素添加到药用植物的培养基中，用于增加有效药用成分的产量，这方面国内外已有若干报道。Xu et al.（2005）在研究单线态氧对人参培养细胞的影响时，发现用乙烯处理人参细胞，能促进皂苷合成，而当乙烯生产被阻碍时，皂苷合成也被抑制，说明乙烯是皂苷合成所必需的基本信号。Bae et al.（2006）报道50 μmol·L-1的乙烯利能加强人参根的生长和人参皂苷的积累，而100 μmol·L-1会抑制皂苷的积累。这说明乙烯不仅可以作为信号分子调节人参的生长发育和调节皂苷的积累，而且对次生代谢产物有着双重调控作用，即在一定浓度范围内可以促进次生代谢产物的形成， 高于一定浓度， 则对次生代谢产物的形成起抑制作用。在本研究的对照植株中，幼叶的总皂苷含量最高，其次是茎和成熟叶，这与刘世彪等（2005）对自然生长的绞股蓝不同器官中的皂苷含量测定结果相符。用乙烯利处理绞股蓝植株后，根、成熟叶和幼叶的总皂苷含量均显著增加，仅茎中的增加不显著，这说明乙烯确实能够促进绞股蓝总皂苷的合成和积累。 绞股蓝皂苷含量不仅具有地域差异性，而且具有单体种类差异性。史美荣等（2015）测定绞股蓝植株中人参皂苷Rb1、Rb3、Rd和绞股蓝皂苷XLIX和XVII共5种单体含量，发现Rb3在绞股蓝植株里含量高。本文所测定的人参皂苷Rb1、Rb3和Rd种类，也证实Rb3含量远高于Rb1和Rd。本研究证明乙烯利处理不仅对不同皂苷单体的含量有明显影响，而且具有器官特异性，如乙烯利处理虽能显著增加根中的Rb3及茎中的Rb1和Rb3单体的含量，但显著降低成熟叶中Rd含量，对幼叶中的这3种单体含量没有影响。绞股蓝皂苷的种类多样，受乙烯影响的皂苷单体不会局限于这3种。
法呢基焦磷酸合成酶（FPS）、鲨烯合成酶（SS）和鲨烯环氧酶（SE）是三萜皂苷生物合成途径中关键的一组酶，其基因的表达水平与皂苷的合成产量具有直接的关系。在人参培养细胞中添加ACC（乙烯前体1-氨基环丙烷羧酸，乙烯合成前体物），能够诱SS和SE的上调表达，明显增加皂苷的积累（Xu et al.， 2005）。SS和SE是绞股蓝皂苷生物合成关键酶，最近已被证明在不同光质处理下，绞股蓝这两种基因的表达量与其皂苷含量呈正相关关系（Wang et al.， 2018）。在本研究中，对绞股蓝外施乙烯利能显示出GpFPS、GpSS和GpSE的基因表达呈不同程度地上调，说明乙烯能够调节皂苷合成关键酶FPS、SS和SE的基因表达，并导致后续的皂苷含量增加。同时，本研究还发现，这3个基因在不同器官间的表达模式不同，但在同一器官中的表达模式却相似。这表明这3个基因在乙烯刺激下，同一器官中虽以集群协同的方式参与绞股蓝皂苷的生物合成，但不同器官的绞股蓝皂苷合成并不同步。在乙烯利处理后2 h和6 h，GpSE和GpSS在幼叶中的表达量均高于成熟叶，这与用茉莉酸甲酯（MeJA）处理绞股蓝后这2个基因前期的上调表达模式相似（Guo et al.， 2016;李茹芳等，2016），说明幼叶的皂苷合成能力更强。本研究结果有助于对乙烯调节绞股蓝皂苷合成机制的进一步了解，为利用乙烯等植物激素调控皂苷等次生代谢提供参考。但是，目前人们对乙烯与植物次生代谢物生成的关系和调控机制还了解得不多（Rahimi et al.， 2015），如乙烯是调节皂苷合成中的哪些过程，是基因表达阶段还是后续的过程以及乙烯浓度的双重调控与基因表达和皂苷生成的关系等都值得进一步研究。
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（责任编辑 周翠鸣）
关键词： 绞股蓝， 乙烯， 皂苷， 基因表达， 植物器官
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文献标识码： A
文章编号： 1000-3142（2021）06-1014-07
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*通信作者： 刘世彪，博士，教授，研究方向为发育植物学和植物资源学，（E-mail）liushibiao_1@163.com。
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Abstract： The effects of plant hormone ethylene on gypenoside biosynthesis-related key enzyme gene expression and gypenoside content in medicine-food plant Gynostemma pentaphyllum were analyzed in this study. Fluorescence quantitative PCR was employed to test the expression levels of GpFPS， GpSS and GpSE， key enzyme genes in saponin biosynthesis pathway in different organs of G. pentaphyllum treated with ethephon， while spectrophotometry and HPLC were used to assay the contents of total gypenoside and saponin monomer Rb1， Rb3 and Rd in G. pentaphyllum. The results were as follows： （1） The expression levels of GpFPS， GpSS and GpSE genes were up-regulated by addition of ethephon in different extents， and the expression patterns of these three genes were dissimilar in different organs， but similar in the same organ. （2） The contents of total gypenoside in all organs increased when compared with the control， and those in root， mature leaf and young leaf arrived at significant level 3 d after ethephon treatment; However， the three saponin monomers increased or decreased in organs were inconsistency， with Rb3 had the highest content. The results provide reference for the research of using plant hormone to regulate the secondary metabolism in G. pentaphyllum. Key words： Gynostemma pentaphyllum， ethylene， gypenoside， gene expression， plant organ
绞股蓝（Gynostemma pentaphyllum）又名五叶参、七叶参、七叶参胆、小苦草、遍地生根等，为葫芦科（Cucurbitaceae）绞股蓝属（Gynostemma Blume）的多年生草质藤本植物。绞股蓝可制成保健茶，也可作为野菜食用，入药则具有降血压、降血脂、助消化、延缓衰老、调节神经系统和免疫功能的作用，属于重要的药食两用植物（Yan et al.， 2014;彭小列等，2017;Wang et al.， 2018）。绞股蓝体内的主要药用成分为绞股蓝皂苷（gypenoside），现已分离得到结构明确的绞股蓝皂苷201种（范冬冬等，2017）。绞股蓝皂苷在结构上和人参皂苷类似，绞股蓝皂苷3、4、8分别与人参皂苷Rb1、Rb3、Rd 结构相同，其生物合成途径也与人参相同。
人参皂苷属于四环三萜类化合物，是类异戊二烯代谢途径中三萜类合成支路的产物，其生物合成分为三个阶段。第一阶段：通过甲羟戊酸途径（mevalonate pathway，MVA）和2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸途径（methylery-thritol phosphate pathway，MEP），合成主要的中间产物异戊烯基焦磷酸（isopentenyldiphosphate，IPP）與二甲烯丙基二磷酸（dimethylallyl diphos-phate，DMAPP）。第二阶段：IPP和DMAPP被牻牛儿基焦磷酸合成酶（geranylgeranyl pyrophosphate synthase，GPS）、法呢基焦磷酸合成酶（farnesyl diphosphate synthase，FPS）、鲨烯合成酶（squalene synthase，SS）和鲨烯环氧酶（squalene epoxidase，SE）催化合成 2，3-氧化鲨烯。第三阶段：2，3-氧化鲨烯经过环化、羟基化、糖基化等过程后，最终形成Rb1、Rb3、Rd等不同类型的人参皂苷（赵灿等，2015;林彦萍，2016）。
乙烯（ethylene，ET）是一种植物内源激素，能够广泛调控植物生长发育、抵抗逆境及次生代谢产物合成等生理活动（Zhao et al.， 2005;方俊华等，2014）。乙烯已用于提高具有一定药用价值的植物次生代谢产物产量，如用乙烯利刺激檀香植株，能够增加檀香叶中总黄酮的含量（文海涛等，2010），在红豆杉细胞培养中添加0.018 mL·L-1的乙烯可大幅度提高紫杉烷的产量（Pan et al.， 2000）。在对五加科植物人参的研究中已有报道，乙烯可以作为信号分子调节人参的生长发育和人参皂苷的积累（Bae et al.， 2006）。乙烯对皂苷积累的影响与其对鲨烯合成酶和鲨烯环氧酶基因基因表达的诱导有直接的关系，如用乙烯前体 1- 氨基环丙烷羧酸（ACC）处理人参培养细胞可以诱导鲨烯合成酶和鲨烯环氧酶基因的转录表达，并能导致皂苷含量的上升（Xu et al.， 2005）。因此，可以确认乙烯对人参皂苷类生物合成具有必然的影响。然而，其影响机制尚不明确（Rahimi et al.， 2015）。绞股蓝是除五加科以外唯一的含有人参皂苷的植物，被誉为“南方人参”。植物激素乙烯对绞股蓝的影响是否与对人参的影响模式相类似，目前尚未见报道。本文研究了外源乙烯利（一种乙烯释放剂）对绞股蓝皂苷生物合成关键酶FPS、SS和SE的基因表达、绞股蓝总皂苷及皂苷单体Rb1、Rb3和Rd含量的调控作用，旨在探讨乙烯对绞股蓝皂苷类物质合成积累的影响机制，为发展绞股蓝的高效栽培技术提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
所用材料为扦插扩繁的绞股蓝植株，种植在人工培养室中，温度25 ℃，相对湿度60%，12 h光照，光照强度40 μmol·m-2·s-1，培养40 d。实验处理时插口虽有须根生长，但无根状茎发育。选取长势一致且长出10～12片新叶的植株，以0.5%乙烯利喷施叶面至溶液即将流出叶片为准，对照植株喷施超纯水（CK）。分别在乙烯利处理后的2 h、6 h和3 d取样，在每个时间点分别取5株的幼叶、成熟叶、茎和根。用于PCR分析的材料立即投入液氮中备用;用于皂苷含量测定的材料在60 ℃烘箱中烘干24 h至衡重，干燥器中保存备用。每个处理取3次生物学重复。
1.2 方法
1.2.1 总RNA的提取与cDNA的合成 RNA prep Pure Plant Kit [天根生化科技（北京）有限公司，DP441]试剂盒说明，提取绞股蓝各组织的总RNA，使用DNase Ⅰ去除RNA样品中的微量DNA。采用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Fisher Scientific Inc.，K1662），按照1 μg的总RNA量，进行等量反转录合成cDNA。
1.2.2 荧光定量PCR分析 在NCBI数据库中搜索本研究的绞股蓝各基因的序列，使用primer premier 6.0软件设计基因的荧光定量PCR引物序列如表1。
荧光定量反应体系为10 μL，其中包括2×SYBR Premix 5 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL （引物浓度为10 μmol·L-1，反应体系中每条引物终浓度均为0.2 μmol·L-1）、cDNA模板2 μL、ddH 2 O2 2 μL。qPCR反应在Bio-Rad公司的CFX实时荧光定量PCR仪中进行，按仪器使用说明书进行操作，qPCR反应程序：95 ℃预变性3 min;95 ℃变性10 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，共40个循环;然后进行溶解曲线分析。利用CFX manager 3.0软件自动进行基线和Cq值分析。根据Q=2-△△Cq计算基因的表达值。 1.2.3 总皂苷与皂苷单体的测定
1.2.3.1 总皂苷的测定 参考宋小妹等（1998）的方法，采用超声波提取法提取粗总皂苷，用色谱甲醇溶解烘干的粗总皂苷，定容至10 mL，即制成总皂苷样品溶液;采用比色法测定总皂苷含量，以购置于中国药品生物制品鉴定所的绞股蓝总皂苷（≥98%）为标准品，在波长550 nm处测定吸光度。以吸光度（A）为纵坐标Y，浓度（C）为横坐标X进行线性回归，得到回归方程。Y=1.559 6X-0.066 2 （R2=0.998 8）。将制备好的总皂苷样品溶液按上述方法进行检测，所得数据按标准曲线方程换算成总皂苷含量。
1.2.3.2 皂苷单体的测定 参考史美荣等（2015）的高效液相色谱法测定皂苷单体。绞股蓝皂苷单体标准品（≥98%）用孔径为0.22 μm的滤膜进行过滤，注入进样小瓶中。使用安捷伦（Agilent Technologies）的高效液相色谱仪进样进行HPLC检测，检测的条件如表2所示。根据已有的高效液相色谱条件测定峰面积，由已知的浓度和得出的峰面积进行方程计算，以浓度X为横坐标，峰面积Y为纵坐标绘标准曲线，得出直线回归方程如下。Rb1：Y=22.726X-99.254 （R2=0.918 2）;Rb3：Y=45.997X-33.976 （R2=0.999 2）;Rd：Y=44.715X-65.191 （R2=0.999 5）。将制备好的皂苷样品溶液按上述方法检测，所得数据按标准曲线方程换算成皂苷单体含量。
1.2.4 數据处理分析 用Excel 2007软件整理数据，处理组和对照组之间的差异显著性分析用SPSS 20.0软件进行单因素AVONA检验。*表示差异显著（P<0.05），**表示差异极显著（P<0.01）。
2 结果与分析
2.1 乙烯对绞股蓝皂苷生物合成关键酶FPS、SS和SE基因表达的影响
乙烯对绞股蓝根、茎、成熟叶和幼叶中的皂苷生物合成关键酶FPS、SS和SE基因表达的影响如图1所示。在根中，GpFPS呈明显上调表达，且2 h和6 h的表达量显著高于对照，6 h的表达量最大，至处理后3 d时与对照无显著差异;根中的GpSS在6 h时的表达量显著高于对照，而2 h和3 d的表达量与对照没有显著差异;根中的GpSE在处理后2 h和6 h的表达量显著升高，3 d时与对照无差异。在茎中，GpFPS呈极显著上调表达，2 h表达量最大，随后表达量虽逐渐降低，但均高于对照;茎中的GpSS在处理后2 h的表达量最大，显著高于对照，6 h时与对照相似，到3 d时又显著上调;茎中的GpSE在处理后2 h即达最高值，显著高于对照，其后两阶段急剧下降至对照水平。在成熟叶中，GpFPS在2 h时与对照水平相当，到6 h和3 d显著上调表达，3 d表达量达到最大值;GpSS的表达量在2 h时显著低于对照，到6 h时已恢复到对照水平，3 d时呈显著上调表达;GpSE的表达水平则呈连续的显著上升趋势，至3 d时达最高。在幼叶中，GpFPS的表达量呈明显的连续降低模式，2 h和6 h显著高于对照，3 d时显著低于对照;GpSS在2 h时的表达量显著高于对照，6 h时与对照无显著差异，3 d时有显著上升;GpSE在2 h和6 h的表达量显著高于对照，以6 h最高，在3 d时降至对照水平。在根、茎和成熟叶三个器官中，GpSE的表达模式与GpFPS的表达模式大致相似，在茎和幼叶中，GpFPS和GpSS的表达模式大致相似。
总体来看，这3个基因在同一器官中响应乙烯利的表达模式相似。乙烯利处理后，在根中，GpFPS、GpSS和GpSE均是在6 h时显著高于对照且表达量最大;在茎中，它们的表达量在2 h均达到最大值，且显著高于对照;在成熟叶中，这3个基因对乙烯利的响应表现为持续上调表达，在处理后3 d的表达量均达到最大值，且显著高于对照;在幼叶中，3个基因在乙烯利处理2 h的表达量均显著高于对照。
2.2 乙烯对不同器官总皂苷和皂苷单体含量的影响
乙烯利处理3 d时的绞股蓝总皂苷和3种皂苷单体的含量如图2所示。处理植株的根、茎、成熟叶和幼叶的总皂苷含量平均值分别为15.33、75.23、69.64和110.67（mg·g-1FW）。对照植株的根、茎、成熟叶和幼叶的总皂苷含量平均值分别为7.84、61.75、37.53和80.67（mg·g-1FW）。差异显著性分析表明，处理植株的根、茎、成熟叶和幼叶的总皂苷含量均高于对照，其中根、成熟叶和幼叶达到显著水平，而茎与对照差异不显著。
乙烯利处理下绞股蓝3种皂苷单体的含量各不相同，其变化也不同于总皂苷含量。差异显著性分析表明，茎的Rb1含量显著高于对照，成熟叶和幼叶含量高于对照，根的含量低于对照，它们均未达到显著水平;根和茎的Rb3含量显著高于对照，成熟叶和幼叶的Rb3含量低于对照，没有显著差异;Rd在成熟叶中的含量显著低于对照，在根、茎和幼叶中与对照没有显著差异。总体来看，3种单体在植株中的分布具有器官特异性，且Rb3的含量高于其他2个单体。
3 讨论与结论
植物激素可调控植物体内次生代谢产物的合成，乙烯也不例外，作为唯一的气态植物激素，它不仅是环境变化和植物发育、适应的桥梁（张睿等，2020），而且常被作为外源激素添加到药用植物的培养基中，用于增加有效药用成分的产量，这方面国内外已有若干报道。Xu et al.（2005）在研究单线态氧对人参培养细胞的影响时，发现用乙烯处理人参细胞，能促进皂苷合成，而当乙烯生产被阻碍时，皂苷合成也被抑制，说明乙烯是皂苷合成所必需的基本信号。Bae et al.（2006）报道50 μmol·L-1的乙烯利能加强人参根的生长和人参皂苷的积累，而100 μmol·L-1会抑制皂苷的积累。这说明乙烯不仅可以作为信号分子调节人参的生长发育和调节皂苷的积累，而且对次生代谢产物有着双重调控作用，即在一定浓度范围内可以促进次生代谢产物的形成， 高于一定浓度， 则对次生代谢产物的形成起抑制作用。在本研究的对照植株中，幼叶的总皂苷含量最高，其次是茎和成熟叶，这与刘世彪等（2005）对自然生长的绞股蓝不同器官中的皂苷含量测定结果相符。用乙烯利处理绞股蓝植株后，根、成熟叶和幼叶的总皂苷含量均显著增加，仅茎中的增加不显著，这说明乙烯确实能够促进绞股蓝总皂苷的合成和积累。 绞股蓝皂苷含量不仅具有地域差异性，而且具有单体种类差异性。史美荣等（2015）测定绞股蓝植株中人参皂苷Rb1、Rb3、Rd和绞股蓝皂苷XLIX和XVII共5种单体含量，发现Rb3在绞股蓝植株里含量高。本文所测定的人参皂苷Rb1、Rb3和Rd种类，也证实Rb3含量远高于Rb1和Rd。本研究证明乙烯利处理不仅对不同皂苷单体的含量有明显影响，而且具有器官特异性，如乙烯利处理虽能显著增加根中的Rb3及茎中的Rb1和Rb3单体的含量，但显著降低成熟叶中Rd含量，对幼叶中的这3种单体含量没有影响。绞股蓝皂苷的种类多样，受乙烯影响的皂苷单体不会局限于这3种。
法呢基焦磷酸合成酶（FPS）、鲨烯合成酶（SS）和鲨烯环氧酶（SE）是三萜皂苷生物合成途径中关键的一组酶，其基因的表达水平与皂苷的合成产量具有直接的关系。在人参培养细胞中添加ACC（乙烯前体1-氨基环丙烷羧酸，乙烯合成前体物），能够诱SS和SE的上调表达，明显增加皂苷的积累（Xu et al.， 2005）。SS和SE是绞股蓝皂苷生物合成关键酶，最近已被证明在不同光质处理下，绞股蓝这两种基因的表达量与其皂苷含量呈正相关关系（Wang et al.， 2018）。在本研究中，对绞股蓝外施乙烯利能显示出GpFPS、GpSS和GpSE的基因表达呈不同程度地上调，说明乙烯能够调节皂苷合成关键酶FPS、SS和SE的基因表达，并导致后续的皂苷含量增加。同时，本研究还发现，这3个基因在不同器官间的表达模式不同，但在同一器官中的表达模式却相似。这表明这3个基因在乙烯刺激下，同一器官中虽以集群协同的方式参与绞股蓝皂苷的生物合成，但不同器官的绞股蓝皂苷合成并不同步。在乙烯利处理后2 h和6 h，GpSE和GpSS在幼叶中的表达量均高于成熟叶，这与用茉莉酸甲酯（MeJA）处理绞股蓝后这2个基因前期的上调表达模式相似（Guo et al.， 2016;李茹芳等，2016），说明幼叶的皂苷合成能力更强。本研究结果有助于对乙烯调节绞股蓝皂苷合成机制的进一步了解，为利用乙烯等植物激素调控皂苷等次生代谢提供参考。但是，目前人们对乙烯与植物次生代谢物生成的关系和调控机制还了解得不多（Rahimi et al.， 2015），如乙烯是调节皂苷合成中的哪些过程，是基因表达阶段还是后续的过程以及乙烯浓度的双重调控与基因表达和皂苷生成的关系等都值得进一步研究。
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（责任编辑 周翠鸣）