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摘 要 采用盆栽方法，研究5、10、15、20、25、30 mg/L铜水平对咖啡幼苗超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）以及叶绿素含量的影响。试验结果表明，铜浓度在0～30 mg/L，咖啡幼苗叶绿素含量先上升后下降；SOD、CAT、POD活性先升高后下降；MDA含量则一直呈现增加的趋势。结果表明，咖啡幼苗对铜胁迫比较敏感，容易受到铜毒害的影响。
关键词 铜 ；咖啡幼苗 ；生理指标
分类号 S571.2
Effects of Copper Level on Several Physiological Indices of Coffee Seedlings
WANG Yaling LI Weifeng MA Jinyuan WANG Yonglin
（Yunnan Vocational College of Tropical Crops， Puer， Yunnan 665000， China）
Abstract Pot culture method was used to study the transformation of SOD， POD， CAT， MDA and chlorophyll content of coffee seedling with the Cu concentrations of 5， 10， 15， 20， 25， 30 mg/L. The result showed that when copper concentration was 0～30 mg/L， chlorophyll content increased first and then decreased. The activities of SOD， CAT and POD went up at the beginning，but they were decreased as the quantity of copper increasing， and the MDA content increased all the time. The result suggested that coffee seedling was sensitive to Cu stress， its growth was easily influenced by copper toxicity.
Keywords Cu ； coffee seedling ； physiological indexes
近年来，由于高铜杀菌剂、工业污水灌溉、尾矿矿渣污染等多种因素的影响，环境中铜污染日趋严重。铜是植物生长发育过程中所必需的一种微量金属元素，也是植物体内多种酶的重要组分之一，对植物的正常发育具有重要的意义。但植物正常生长所需铜量非常少，土壤中铜含量过高会对植物产生严重的毒害作用。研究发现，过量的铜被植物吸收后，不仅会阻碍蛋白质的正常合成，而且会使叶绿素含量降低，影响植物光合作用，从而导致植物生长量下降[1-3]。铜污染对植物的毒害问题引起了国内外研究人员的重视，目前已经进行了较多的研究[4-6]，但是铜胁迫对咖啡幼苗生理的影响研究未见报道。因此本研究以云南小粒种咖啡为供试材料，通过砂盆法，探索铜胁迫对咖啡幼苗若干生理代谢指标的影响，以期为深入研究铜对咖啡伤害和咖啡的耐铜机理提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料
供试咖啡幼苗品种为卡萨姆P3，栽培于云南热带作物职业学院温室大棚育苗床。选取生长健壮具三对叶的咖啡幼苗作试验对象，幼苗根部洗净泥沙，用0.1%高锰酸钾浸泡根部消毒10 min，将消毒好的咖啡幼苗用去离子水冲洗干净。培养液母液为Hoagland-Arnon营养液，铜胁迫溶液则采用五水硫酸铜配制，用去离子水将硫酸铜配制成1 g/L的溶液，然后按照不同比例加入Hoagland-Arnon营养液中，分别配制成浓度为5、10、15、20、25和30 mg/L的铜胁迫溶液。栽培基质采用60～80目分析纯石英砂，用0.1%高锰酸钾浸泡消毒，蒸馏水洗净后烘干后备用。
1.2 方法
1.2.1 试验设计
将处理好的石英砂装入塑料盆，每盆植入四株咖啡幼苗，将栽好的试验盆放置于温室内培养，用Hoagland-Arnon营养液浇灌，待咖啡幼苗恢复正常生长一周后，将配好的铜胁迫营养液分别加入花盆内进行胁迫试验，每盆每日浇灌20 mL不同胁迫浓度的铜溶液，使盆内沙基湿度维持在75%左右，每个胁迫浓度设3个重复，胁迫处理2个月后进行取样，测定各项指标。
1.2.2 项目测定
过氧化物酶活性测定采用愈创木酚法[7]，丙二醛含量采用TBA法测定[8]，过氧化氢酶活性采用紫外吸收法测定[9]，超氧化物歧化酶活性采用NBT光化还原法测定[7]，叶绿素含量采用丙酮浸提法[10]。
1.2.3 数据分析
试验结果采用Excel2003进行处理分析。
2 结果与分析
2.1 铜胁迫对咖啡幼苗叶绿素含量的影响
叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，叶绿素含量的变化可以直接反映出植物光合作用的变化情况。从表1可以看出，随着铜处理浓度的增大，咖啡幼苗叶片内叶绿素a、b及总量表现为先升后降，其中5 mg/L的铜处理的咖啡幼苗叶绿素总量较空白对照上升了9.5%，但铜浓度达到15 mg/L后叶绿素含量又迅速下降，当铜浓度达30 mg/L时，叶绿素含量较空白对照下降了18.36%。
2.2 铜胁迫对咖啡幼苗SOD活性的影响
SOD是植物体内清除活性氧自由基的抗氧化保护酶，是防止氧自由基对细胞膜产生伤害的重要的保护酶，在一定胁迫下，SOD活性会提高，从而增强植物的抗逆能力[11]。由表2可见，咖啡幼苗在低浓度铜胁迫下SOD活性呈升高趋势，5 mg/L的铜胁迫下的咖啡幼苗SOD活性较空白对照上升了17.48%，但铜浓度达到15 mg/L后SOD活性又迅速下降，当铜浓度达30 mg/L时，SOD活性较空白对照下降了31.66%。 2.3 铜胁迫对咖啡幼苗CAT活性的影响
CAT是催化细胞内过氧化氢分解为水和氧气的一种酶，存在于几乎所有生物体中，对维持细胞内正常水平的过氧化氢有着重要的作用，其活性的强弱与过氧化氢的积累有着直接的关系。由表2可知，在铜胁迫处理下，CAT活性随铜胁迫的加剧呈先升高后降低的态势，在铜10 mg/L处理达到最大值，为空白对照的113.96%。而铜浓度达到15 mg/L后，CAT活性随铜胁迫的加剧呈明显降低趋势。当铜浓度达30 mg/L时，CAT活性较空白对照下降了26.9%。
2.4 铜胁迫对咖啡幼苗POD活性的影响
POD是植物体内抗氧化防御系统的关键酶之一，其与过氧化氢酶、超氧化物歧化酶配合，清除植物体内的过量自由基，增强植物的抗逆能力[12]。如表2所示，随着铜胁迫浓度的增加，POD活性先增加后降低，在铜胁迫浓度为5 mg/L时，其活性对比空白对照上升了15.29%，但铜胁迫浓度超过15 mg/L后，POD活性逐渐降低，在30 mg/L铜胁迫下，其活性对比空白对照下降了33.16%。
2.5 铜胁迫对咖啡幼苗MDA活性的影响
MDA是逆境条件下植物细胞膜质过氧化作用的产物之一，MDA含量往往作为细胞膜质过氧化程度的指标。试验结果（表2）表明，在重金属铜胁迫下，咖啡幼苗MDA的含量随铜浓度增加而升高，在30 mg/L铜胁迫下，其含量对比空白对照增加了68.7%。
3 讨论与结论
叶绿素是植物吸收光能合成有机化合物的主要色素，其含量的高低直接反映了植物利用光能合成有机化合物能力的强弱。试验发现，低浓度铜胁迫下，咖啡幼苗体内叶绿素a、b及总含量均有所升高；而高浓度的铜会导致叶绿素含量急剧降低，这与前人的研究结果相同[13]，低浓度的铜可以作为叶绿体质蓝素的组成部分，并可活化叶绿素合成过程中的某些酶，刺激叶绿素的合成，故而使叶绿素含量升高[14]；但铜离子浓度过高时，植物体内叶绿体酶活性失调，导致叶绿素分解加速，此外，高浓度铜胁迫导致POD活性上升也会加速叶绿素降解[11]。
植物体内存在一系列抗氧化保护酶系统，能够清除活性氧自由基，使其在一个较低的浓度，保证植物正常生长，但是在逆境胁迫下，植物体内活性氧自由基大量产生，打破了其在植物体内的代谢平衡，造成活性氧自由基大量积累，从而对植物造成伤害[15]。植物体内SOD、POD、CAT等抗氧化保护酶能及时清除逆境胁迫诱导产生的过多的活性氧自由基，它们与植物抗逆性密切相关。试验证明，咖啡幼苗SOD、POD、CAT活性低在浓度铜胁迫下均升高，这可能是低浓度的铜作用下酶的底物浓度升高所致；高浓度铜胁迫下，3种酶活性迅速下降，则可能是铜破坏了酶的分子结构，而且铜胁迫下产生的活性氧浓度过高，攻击酶本身，表现为3种酶活性明显降低。此外，在本试验中，植物细胞膜质大分子氧化产物MDA的含量随铜胁迫浓度的升高而增加，亦说明随铜胁迫浓度的增加，咖啡幼苗膜质过氧化加重，铜中毒程度加深。
参考文献
[1] 司 琴，张徐祥，王友保，等. 污灌对小麦幼苗生长及活性氧代谢的影响[J]. 应用生态学报，2002，13（10）：1 319-1 322.
[2] 林义章，徐 磊. 铜污染对高等植物的生理毒害作用研究[J]. 中国生态农业学报，2007，15（1）：201-204.
[3] 刘登义，谢建春，杨世勇. 等. 铜尾矿对小麦生长发育和生理功能的影响[J]. 应用生态学报， 2001，12（1）：126-128.
[4] 吴燕玉，王 新，梁仁禄，等. Cd、Pb、Cu、Zn 、As复合污染在农田生态系统的迁移动态研究[J]. 环境科学学报， 1998，18（4）：407-414.
[5] 余国营，吴燕玉，王 新. 重金属复合污染对大豆生长的影响及其综合评价研究[J]. 应用生态学报，1995，6（4）：433-439.
[6] 郑春荣，陈怀满. 土壤-水稻体系中污染重金属的迁移及其对水稻的影响[J]. 环境科学学报，1990，10（2）：145-152.
[7] 沈文飚，徐朗莱，叶茂炳，等. 氮蓝四唑光化还原法测定超氧化物歧化酶活性的适宜条件[J]. 南京农业大学学报，1996，19（2）：101-102.
[8] 熊庆娥. 植物生理学实验教程[M]. 成都：四川科学技术出版社，2003：122-126.
[9] 陈小敏. 测定切花中过氧化氢酶活性的3 种常用方法的比较[J]. 热带农业科学，2002，22（5）：13-16.
[10] 郝建军. 植物生理学试验技术[M].沈阳：辽宁科学技术出版社，2004：178-190.
[11] 曾韶西，王以柔，刘鸿先. 低温光照下与黄瓜叶叶绿素降解有关的酶促反应[J]. 植物生理学报，1991，17（2）：177-181.
[12] 刘素纯，萧浪涛，廖柏寒，等. Pb胁迫对黄瓜幼苗抗氧化酶活性及同功酶的影响[J]. 应用生态学报，2006，17（2）：300-304.
[13] 储 玲，刘登义，王友保，等. 铜污染对三叶草幼苗
生长及活性氧代谢影响的研究[J]. 应用生态学报，2004，15（1）：119-122.
[14] 赵青云，王 辉，王 华，等. 不同微量元素对苦丁茶冬青新稍的影响[J]. 热带农业科学，2013，33（11）：9-11.
[15] 李兆君，马国瑞，徐建民，等. 植物适应重金属Cd胁迫的生理及分子生物学机理[J]. 土壤通报，2004，35（2）：234-238.
关键词 铜 ；咖啡幼苗 ；生理指标
分类号 S571.2
Effects of Copper Level on Several Physiological Indices of Coffee Seedlings
WANG Yaling LI Weifeng MA Jinyuan WANG Yonglin
（Yunnan Vocational College of Tropical Crops， Puer， Yunnan 665000， China）
Abstract Pot culture method was used to study the transformation of SOD， POD， CAT， MDA and chlorophyll content of coffee seedling with the Cu concentrations of 5， 10， 15， 20， 25， 30 mg/L. The result showed that when copper concentration was 0～30 mg/L， chlorophyll content increased first and then decreased. The activities of SOD， CAT and POD went up at the beginning，but they were decreased as the quantity of copper increasing， and the MDA content increased all the time. The result suggested that coffee seedling was sensitive to Cu stress， its growth was easily influenced by copper toxicity.
Keywords Cu ； coffee seedling ； physiological indexes
近年来，由于高铜杀菌剂、工业污水灌溉、尾矿矿渣污染等多种因素的影响，环境中铜污染日趋严重。铜是植物生长发育过程中所必需的一种微量金属元素，也是植物体内多种酶的重要组分之一，对植物的正常发育具有重要的意义。但植物正常生长所需铜量非常少，土壤中铜含量过高会对植物产生严重的毒害作用。研究发现，过量的铜被植物吸收后，不仅会阻碍蛋白质的正常合成，而且会使叶绿素含量降低，影响植物光合作用，从而导致植物生长量下降[1-3]。铜污染对植物的毒害问题引起了国内外研究人员的重视，目前已经进行了较多的研究[4-6]，但是铜胁迫对咖啡幼苗生理的影响研究未见报道。因此本研究以云南小粒种咖啡为供试材料，通过砂盆法，探索铜胁迫对咖啡幼苗若干生理代谢指标的影响，以期为深入研究铜对咖啡伤害和咖啡的耐铜机理提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料
供试咖啡幼苗品种为卡萨姆P3，栽培于云南热带作物职业学院温室大棚育苗床。选取生长健壮具三对叶的咖啡幼苗作试验对象，幼苗根部洗净泥沙，用0.1%高锰酸钾浸泡根部消毒10 min，将消毒好的咖啡幼苗用去离子水冲洗干净。培养液母液为Hoagland-Arnon营养液，铜胁迫溶液则采用五水硫酸铜配制，用去离子水将硫酸铜配制成1 g/L的溶液，然后按照不同比例加入Hoagland-Arnon营养液中，分别配制成浓度为5、10、15、20、25和30 mg/L的铜胁迫溶液。栽培基质采用60～80目分析纯石英砂，用0.1%高锰酸钾浸泡消毒，蒸馏水洗净后烘干后备用。
1.2 方法
1.2.1 试验设计
将处理好的石英砂装入塑料盆，每盆植入四株咖啡幼苗，将栽好的试验盆放置于温室内培养，用Hoagland-Arnon营养液浇灌，待咖啡幼苗恢复正常生长一周后，将配好的铜胁迫营养液分别加入花盆内进行胁迫试验，每盆每日浇灌20 mL不同胁迫浓度的铜溶液，使盆内沙基湿度维持在75%左右，每个胁迫浓度设3个重复，胁迫处理2个月后进行取样，测定各项指标。
1.2.2 项目测定
过氧化物酶活性测定采用愈创木酚法[7]，丙二醛含量采用TBA法测定[8]，过氧化氢酶活性采用紫外吸收法测定[9]，超氧化物歧化酶活性采用NBT光化还原法测定[7]，叶绿素含量采用丙酮浸提法[10]。
1.2.3 数据分析
试验结果采用Excel2003进行处理分析。
2 结果与分析
2.1 铜胁迫对咖啡幼苗叶绿素含量的影响
叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，叶绿素含量的变化可以直接反映出植物光合作用的变化情况。从表1可以看出，随着铜处理浓度的增大，咖啡幼苗叶片内叶绿素a、b及总量表现为先升后降，其中5 mg/L的铜处理的咖啡幼苗叶绿素总量较空白对照上升了9.5%，但铜浓度达到15 mg/L后叶绿素含量又迅速下降，当铜浓度达30 mg/L时，叶绿素含量较空白对照下降了18.36%。
2.2 铜胁迫对咖啡幼苗SOD活性的影响
SOD是植物体内清除活性氧自由基的抗氧化保护酶，是防止氧自由基对细胞膜产生伤害的重要的保护酶，在一定胁迫下，SOD活性会提高，从而增强植物的抗逆能力[11]。由表2可见，咖啡幼苗在低浓度铜胁迫下SOD活性呈升高趋势，5 mg/L的铜胁迫下的咖啡幼苗SOD活性较空白对照上升了17.48%，但铜浓度达到15 mg/L后SOD活性又迅速下降，当铜浓度达30 mg/L时，SOD活性较空白对照下降了31.66%。 2.3 铜胁迫对咖啡幼苗CAT活性的影响
CAT是催化细胞内过氧化氢分解为水和氧气的一种酶，存在于几乎所有生物体中，对维持细胞内正常水平的过氧化氢有着重要的作用，其活性的强弱与过氧化氢的积累有着直接的关系。由表2可知，在铜胁迫处理下，CAT活性随铜胁迫的加剧呈先升高后降低的态势，在铜10 mg/L处理达到最大值，为空白对照的113.96%。而铜浓度达到15 mg/L后，CAT活性随铜胁迫的加剧呈明显降低趋势。当铜浓度达30 mg/L时，CAT活性较空白对照下降了26.9%。
2.4 铜胁迫对咖啡幼苗POD活性的影响
POD是植物体内抗氧化防御系统的关键酶之一，其与过氧化氢酶、超氧化物歧化酶配合，清除植物体内的过量自由基，增强植物的抗逆能力[12]。如表2所示，随着铜胁迫浓度的增加，POD活性先增加后降低，在铜胁迫浓度为5 mg/L时，其活性对比空白对照上升了15.29%，但铜胁迫浓度超过15 mg/L后，POD活性逐渐降低，在30 mg/L铜胁迫下，其活性对比空白对照下降了33.16%。
2.5 铜胁迫对咖啡幼苗MDA活性的影响
MDA是逆境条件下植物细胞膜质过氧化作用的产物之一，MDA含量往往作为细胞膜质过氧化程度的指标。试验结果（表2）表明，在重金属铜胁迫下，咖啡幼苗MDA的含量随铜浓度增加而升高，在30 mg/L铜胁迫下，其含量对比空白对照增加了68.7%。
3 讨论与结论
叶绿素是植物吸收光能合成有机化合物的主要色素，其含量的高低直接反映了植物利用光能合成有机化合物能力的强弱。试验发现，低浓度铜胁迫下，咖啡幼苗体内叶绿素a、b及总含量均有所升高；而高浓度的铜会导致叶绿素含量急剧降低，这与前人的研究结果相同[13]，低浓度的铜可以作为叶绿体质蓝素的组成部分，并可活化叶绿素合成过程中的某些酶，刺激叶绿素的合成，故而使叶绿素含量升高[14]；但铜离子浓度过高时，植物体内叶绿体酶活性失调，导致叶绿素分解加速，此外，高浓度铜胁迫导致POD活性上升也会加速叶绿素降解[11]。
植物体内存在一系列抗氧化保护酶系统，能够清除活性氧自由基，使其在一个较低的浓度，保证植物正常生长，但是在逆境胁迫下，植物体内活性氧自由基大量产生，打破了其在植物体内的代谢平衡，造成活性氧自由基大量积累，从而对植物造成伤害[15]。植物体内SOD、POD、CAT等抗氧化保护酶能及时清除逆境胁迫诱导产生的过多的活性氧自由基，它们与植物抗逆性密切相关。试验证明，咖啡幼苗SOD、POD、CAT活性低在浓度铜胁迫下均升高，这可能是低浓度的铜作用下酶的底物浓度升高所致；高浓度铜胁迫下，3种酶活性迅速下降，则可能是铜破坏了酶的分子结构，而且铜胁迫下产生的活性氧浓度过高，攻击酶本身，表现为3种酶活性明显降低。此外，在本试验中，植物细胞膜质大分子氧化产物MDA的含量随铜胁迫浓度的升高而增加，亦说明随铜胁迫浓度的增加，咖啡幼苗膜质过氧化加重，铜中毒程度加深。
参考文献
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[10] 郝建军. 植物生理学试验技术[M].沈阳：辽宁科学技术出版社，2004：178-190.
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[12] 刘素纯，萧浪涛，廖柏寒，等. Pb胁迫对黄瓜幼苗抗氧化酶活性及同功酶的影响[J]. 应用生态学报，2006，17（2）：300-304.
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[14] 赵青云，王 辉，王 华，等. 不同微量元素对苦丁茶冬青新稍的影响[J]. 热带农业科学，2013，33（11）：9-11.
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