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摘要[目的]建立以超高效液相色谱法（UPLC）测定槟榔提取液中槟榔碱含量的方法。[方法]采用Waters公司的ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）色谱柱，柱温35 ℃，流动相：乙腈-甲醇-0.1%冰醋酸溶液（每1 000 mL含磷酸二氢钾0.6 g，十二烷基磺酸钠1.0 g）=25∶20∶55，等度洗脱，进样量1.0 μL，流速0.2 mL/min，检测波长215 nm。[结果]整个洗脱在5.0 min之内完成，槟榔碱在2.0 min左右出峰，峰型较好，且槟榔碱在0.013～0.663 mg/mL范围内呈良好的线性关系，相关系数为0.999 8，平均回收率为98.1%，RSD为2.26%（n=5）。[结论]该方法操作简便、快速，灵敏度高，重复性好，可用于控制槟榔提取液及其制成方剂中槟榔碱的含量。
关键词超高效液相色谱法；槟榔提取液；槟榔碱
中图分类号R284.1文献标识码A文章编号0517-6611（2018）08-0177-02
Determination of Arecoline from Areca Nut Extract by Ultrahigh Performance Liquid Chromatography （UPLC）
KONG Lanfen， YANG Shihua， YANG Panpan et al（Yunnan Comtestor Co.， Ltd.，Kunming， Yunnan 650106）
Abstract[Objective] To establish a UPLC method for determination of arecoline in areca nut extract. [Method] The compound was determined by UPLC with WATERS ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm） column. The column temperature was set at 35.0 ℃. The mobile phase consisted of acetonitrile， methanol and 0.1% glacial acetic acid （containing 0.6 g potassium dihydrogen phosphate and 1.0 g twelve alkyl sodium sulfonate per 1 000 mL solution）（25∶20∶55）， with isocratic elution at the flow rate of 0.2 mL/min. The sample volume was 1.0 μL. The determination wavelength was 215 nm. [Result] The whole elution was completed in 5.0 min. The better peak of arecoline appeared in about 2.0 min and there was a good linear range between 0.013-0.663 mg/mL. The correlation coefficient was 0.999 8 with the average recovery rate of the method was 98.1%， RSD =2.26%（n=5）. [Conclusion] The proposed method had the advantages of easy operation， rapid， high sensitivity and reproducible for the content control of arecoline in areca nut extract and its preparation.
Key wordsUltrahigh performance liquid chromatography（UPLC）；Areca nut extract；Arecoline
作者簡介孔兰芬（1984—），女，云南建水人，工程师，硕士，从事医药品、食品等分析研究。*通讯作者，副研究员，博士，从事分析化学研究。
收稿日期2017-12-25；修回日期2018-01-05
槟榔属于棕榈科植物类，具有杀虫消积、降气、行水、截疟等功效，其主要的有效成分为槟榔碱（Arecoline），槟榔碱的化学名为N-甲基-1，2，5，6-四氢烟酸甲酯，其具有一定毒性[1]，且性质并不十分稳定，所以槟榔及其制成方剂中槟榔碱含量有必要得到更好的控制。目前，测定槟榔碱含量的方法主要有酸碱滴定法[2]、薄层色谱法[3]、毛细管电泳法[4]、分光光度法[5]、气相色谱-质谱联用仪[6]、阳离子交换色谱法[7-8]、反相高效液相色谱法[9-14]及高效液相色谱-质谱联用法[15-16]等，鲜见有用UPLC法来测定的报道。笔者采用UPLC法考察了色谱条件和定量的线性范围，并对槟榔碱进行含量测定，以期为今后测定并控制槟榔及其制成方剂中槟榔碱含量提供参考。
1材料与方法
1.1仪器与试药
1.1.1
仪器。ACQUITY UPLC超高效液相色谱系统，配ACQUITY PDA检测器，Empower色谱工作站（Waters公司）；电子天平（Mettler Toledo New Classic MF）。
1.1.2
试药。氢溴酸槟榔碱对照品（百灵威科技有限公司，含量≥98.0%）；槟榔提取液（云南某有限公司）。乙腈、甲醇为色谱纯（DIMA公司），磷酸二氢钾为分析纯（广东汕头市西陇化工厂，含量≥99.0%），十二烷基磺酸钠为优级纯（西亚试剂，含量≥99.0%），冰醋酸为分析纯（西陇化工股份有限公司，含量≥99.5%），无水乙醇（西陇化工股份有限公司，含量≥99.8%）。 1.2方法
1.2.1
色谱条件。色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）分析柱，流动相为乙腈-甲醇-0.1%冰醋酸溶液（每1 000 mL含磷酸二氢钾0.6 g、十二烷基磺酸钠1.0 g）=25∶20∶55，进样量1.0 μL，流速0.2 mL/min，柱温35.0 ℃，检测波长215 nm，分析时间5.0 min。
1.2.2
对照品溶液的制备。精密称取氢溴酸槟榔碱对照品10.3 mg，置于10 mL容量瓶中，加无水乙醇溶解且定容至刻度，摇匀，制成每1 mL含槟榔碱663.46 μg的储备溶液。
1.2.3
供试品溶液的制备。精密移取槟榔碱提取液0.5 mL于50 mL容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，去续滤液，即得。
2结果与分析
2.1线性关系考察
使用梯度稀释方法配制1/2、1/5、1/10、1/20、1/50储备液浓度的校准溶液，使用UPLC测定并制作工作曲线，以槟榔碱峰面积与对应的浓度做线性回归，得到线性回归方程（Y=1.65e+007x+1.52e+005），相关系数（0.999 8），线性范围0.013～0.663 mg/mL。由此可见，该方法具有良好的线性关系，满足样品的定量测定。此外，对照品及供试品溶液的色谱图见图1。
2.2精密度試验
精密吸取浓度为331.73 μg/mL的氢溴酸槟榔碱对照品溶液连续进样5次，每次1.0 μL，测得氢溴酸槟榔碱峰面积平均值为5 796 852 μV·s，峰面积的RSD值为0.17%，表明氢溴酸槟榔碱进样精密度良好。
2.3稳定性试验
取同一批样品的供试品溶液分别在0、2、4、6、8、16、20、24 h进样1.0 μL，按上述色谱条件测定，峰面积的RSD值为0.30 %，表明供试品溶液至少在24 h内稳定。
2.4重复性试验
取同一批样品的供试品溶液5份，平行测定，进样量为1.0 μL，槟榔碱含量为0.115、0.114、0.115、0.115、0.116 mg/mL，平均含量为0.115 mg/mL，含量的RSD值为0.61%，表明该方法重复性较好。
2.5回收率试验
称取同一批样品的槟榔提取液0.5 mL于50 mL容量瓶中（5份），分别加入对照品储备液1.5 mL，再加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，去续滤液，精密吸取1.0 μL，按照“2.1”色谱条件测定，得平均回收率为98.1 %，RSD值为2.26%（表1）。
2.6样品测定
分别精密吸取供试品溶液1.0 μL，注入UPLC，测定，记录峰面积，计算含量，结果3批样品的含量，分别为0.115、0.120、0.118 mg/mL。
3结论与讨论
3.1不同仪器对比
分别取同一对照品在HPLC（Agilent 1260）及UPLC（ACQUITY HClass）上试验，色谱条件除色谱柱型号及规格不同外，其余条件相同。HPLC中是以Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）为分析柱，15.224 min出峰，总分析时间为30 min，与“2.1”相比，分析时间增加6.0倍，表明HPLC及UPLC在相同条件下检测槟榔提取液中的槟榔碱时，UPLC在准确、快速方面显示出更大的优势。
3.2不同流动相选择
经查阅相关资料[16-17]，选择①乙腈-0.5%甲酸溶液（50∶50或10∶90）；②乙腈-甲醇-0.5%甲酸溶液（20∶35∶45）；③乙腈-0.1%冰醋酸溶液（每1 000 mL含磷酸二氢钾0.6 g，十二烷基磺酸钠1.0 g）（42∶58）或（80∶20）为流动相时，结果槟榔碱在8 min以内均未出峰；④选择甲醇-0.1%冰醋酸溶液（每1 000 mL含磷酸二氢钾0.6 g、十二烷基磺酸钠1.0 g）（48∶52）或（55∶45）为流动相，结果槟榔碱在4 min及2.2 min以内出峰，但峰型及峰纯度较差，峰内包含了2个物质的信息；⑤选择乙腈-甲醇-0.1%冰醋酸溶液（每1 000 mL含磷酸二氢钾0.6 g，十二烷基磺酸钠1.0 g）（15∶30∶55）为流动相，3.2 min出峰，但基线不平稳，且拖尾。经反复试验，确定该试验的色谱条件，槟榔碱在2.0 min左右出峰，峰型较好，拖尾明显改善。从上述各种条件尝试后还得出，随着甲醇比例的加大，出峰时间会相应提前，加入一定量的乙腈，有利于改善峰型。
采用该法测定槟榔提取液中的槟榔碱含量，分析时间为5.0 min，与HPLC法相比，该法操作简便、快速，灵敏度高，重复性好，为今后测定并控制槟榔及其制成方剂中槟榔碱的含量提供参考。
参考文献
[1] 柯铭清.中草药有效成分理化与药理特性[M].长沙：湖南科学技术出版社，1992：426.
[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：2005年一版[S].北京：化学工业出版社，2005：254.
[3] 林励，徐鸿华，邓沛峰，等.槟榔中槟榔碱含量的薄层扫描测定[J].中国中药杂志，1992，17（8）：491-492.
[4] 袁炜，吕建德，傅小芸.槟榔中槟榔碱和槟榔次碱的毛细管电泳分析[J].分析化学，2000，28（6）：749-752.
[5] 高敏，高淑芹.光度法测定槟榔中槟榔碱的含量[J].化学分析计量，2003，12（1）：28-30.
[6] 陈妤，闫晓楠.藿香正气软胶囊中槟榔碱的限量检查方法研究[J].天津药学，2017，29（5）：21-23.
关键词超高效液相色谱法；槟榔提取液；槟榔碱
中图分类号R284.1文献标识码A文章编号0517-6611（2018）08-0177-02
Determination of Arecoline from Areca Nut Extract by Ultrahigh Performance Liquid Chromatography （UPLC）
KONG Lanfen， YANG Shihua， YANG Panpan et al（Yunnan Comtestor Co.， Ltd.，Kunming， Yunnan 650106）
Abstract[Objective] To establish a UPLC method for determination of arecoline in areca nut extract. [Method] The compound was determined by UPLC with WATERS ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm） column. The column temperature was set at 35.0 ℃. The mobile phase consisted of acetonitrile， methanol and 0.1% glacial acetic acid （containing 0.6 g potassium dihydrogen phosphate and 1.0 g twelve alkyl sodium sulfonate per 1 000 mL solution）（25∶20∶55）， with isocratic elution at the flow rate of 0.2 mL/min. The sample volume was 1.0 μL. The determination wavelength was 215 nm. [Result] The whole elution was completed in 5.0 min. The better peak of arecoline appeared in about 2.0 min and there was a good linear range between 0.013-0.663 mg/mL. The correlation coefficient was 0.999 8 with the average recovery rate of the method was 98.1%， RSD =2.26%（n=5）. [Conclusion] The proposed method had the advantages of easy operation， rapid， high sensitivity and reproducible for the content control of arecoline in areca nut extract and its preparation.
Key wordsUltrahigh performance liquid chromatography（UPLC）；Areca nut extract；Arecoline
作者簡介孔兰芬（1984—），女，云南建水人，工程师，硕士，从事医药品、食品等分析研究。*通讯作者，副研究员，博士，从事分析化学研究。
收稿日期2017-12-25；修回日期2018-01-05
槟榔属于棕榈科植物类，具有杀虫消积、降气、行水、截疟等功效，其主要的有效成分为槟榔碱（Arecoline），槟榔碱的化学名为N-甲基-1，2，5，6-四氢烟酸甲酯，其具有一定毒性[1]，且性质并不十分稳定，所以槟榔及其制成方剂中槟榔碱含量有必要得到更好的控制。目前，测定槟榔碱含量的方法主要有酸碱滴定法[2]、薄层色谱法[3]、毛细管电泳法[4]、分光光度法[5]、气相色谱-质谱联用仪[6]、阳离子交换色谱法[7-8]、反相高效液相色谱法[9-14]及高效液相色谱-质谱联用法[15-16]等，鲜见有用UPLC法来测定的报道。笔者采用UPLC法考察了色谱条件和定量的线性范围，并对槟榔碱进行含量测定，以期为今后测定并控制槟榔及其制成方剂中槟榔碱含量提供参考。
1材料与方法
1.1仪器与试药
1.1.1
仪器。ACQUITY UPLC超高效液相色谱系统，配ACQUITY PDA检测器，Empower色谱工作站（Waters公司）；电子天平（Mettler Toledo New Classic MF）。
1.1.2
试药。氢溴酸槟榔碱对照品（百灵威科技有限公司，含量≥98.0%）；槟榔提取液（云南某有限公司）。乙腈、甲醇为色谱纯（DIMA公司），磷酸二氢钾为分析纯（广东汕头市西陇化工厂，含量≥99.0%），十二烷基磺酸钠为优级纯（西亚试剂，含量≥99.0%），冰醋酸为分析纯（西陇化工股份有限公司，含量≥99.5%），无水乙醇（西陇化工股份有限公司，含量≥99.8%）。 1.2方法
1.2.1
色谱条件。色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）分析柱，流动相为乙腈-甲醇-0.1%冰醋酸溶液（每1 000 mL含磷酸二氢钾0.6 g、十二烷基磺酸钠1.0 g）=25∶20∶55，进样量1.0 μL，流速0.2 mL/min，柱温35.0 ℃，检测波长215 nm，分析时间5.0 min。
1.2.2
对照品溶液的制备。精密称取氢溴酸槟榔碱对照品10.3 mg，置于10 mL容量瓶中，加无水乙醇溶解且定容至刻度，摇匀，制成每1 mL含槟榔碱663.46 μg的储备溶液。
1.2.3
供试品溶液的制备。精密移取槟榔碱提取液0.5 mL于50 mL容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，去续滤液，即得。
2结果与分析
2.1线性关系考察
使用梯度稀释方法配制1/2、1/5、1/10、1/20、1/50储备液浓度的校准溶液，使用UPLC测定并制作工作曲线，以槟榔碱峰面积与对应的浓度做线性回归，得到线性回归方程（Y=1.65e+007x+1.52e+005），相关系数（0.999 8），线性范围0.013～0.663 mg/mL。由此可见，该方法具有良好的线性关系，满足样品的定量测定。此外，对照品及供试品溶液的色谱图见图1。
2.2精密度試验
精密吸取浓度为331.73 μg/mL的氢溴酸槟榔碱对照品溶液连续进样5次，每次1.0 μL，测得氢溴酸槟榔碱峰面积平均值为5 796 852 μV·s，峰面积的RSD值为0.17%，表明氢溴酸槟榔碱进样精密度良好。
2.3稳定性试验
取同一批样品的供试品溶液分别在0、2、4、6、8、16、20、24 h进样1.0 μL，按上述色谱条件测定，峰面积的RSD值为0.30 %，表明供试品溶液至少在24 h内稳定。
2.4重复性试验
取同一批样品的供试品溶液5份，平行测定，进样量为1.0 μL，槟榔碱含量为0.115、0.114、0.115、0.115、0.116 mg/mL，平均含量为0.115 mg/mL，含量的RSD值为0.61%，表明该方法重复性较好。
2.5回收率试验
称取同一批样品的槟榔提取液0.5 mL于50 mL容量瓶中（5份），分别加入对照品储备液1.5 mL，再加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，去续滤液，精密吸取1.0 μL，按照“2.1”色谱条件测定，得平均回收率为98.1 %，RSD值为2.26%（表1）。
2.6样品测定
分别精密吸取供试品溶液1.0 μL，注入UPLC，测定，记录峰面积，计算含量，结果3批样品的含量，分别为0.115、0.120、0.118 mg/mL。
3结论与讨论
3.1不同仪器对比
分别取同一对照品在HPLC（Agilent 1260）及UPLC（ACQUITY HClass）上试验，色谱条件除色谱柱型号及规格不同外，其余条件相同。HPLC中是以Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）为分析柱，15.224 min出峰，总分析时间为30 min，与“2.1”相比，分析时间增加6.0倍，表明HPLC及UPLC在相同条件下检测槟榔提取液中的槟榔碱时，UPLC在准确、快速方面显示出更大的优势。
3.2不同流动相选择
经查阅相关资料[16-17]，选择①乙腈-0.5%甲酸溶液（50∶50或10∶90）；②乙腈-甲醇-0.5%甲酸溶液（20∶35∶45）；③乙腈-0.1%冰醋酸溶液（每1 000 mL含磷酸二氢钾0.6 g，十二烷基磺酸钠1.0 g）（42∶58）或（80∶20）为流动相时，结果槟榔碱在8 min以内均未出峰；④选择甲醇-0.1%冰醋酸溶液（每1 000 mL含磷酸二氢钾0.6 g、十二烷基磺酸钠1.0 g）（48∶52）或（55∶45）为流动相，结果槟榔碱在4 min及2.2 min以内出峰，但峰型及峰纯度较差，峰内包含了2个物质的信息；⑤选择乙腈-甲醇-0.1%冰醋酸溶液（每1 000 mL含磷酸二氢钾0.6 g，十二烷基磺酸钠1.0 g）（15∶30∶55）为流动相，3.2 min出峰，但基线不平稳，且拖尾。经反复试验，确定该试验的色谱条件，槟榔碱在2.0 min左右出峰，峰型较好，拖尾明显改善。从上述各种条件尝试后还得出，随着甲醇比例的加大，出峰时间会相应提前，加入一定量的乙腈，有利于改善峰型。
采用该法测定槟榔提取液中的槟榔碱含量，分析时间为5.0 min，与HPLC法相比，该法操作简便、快速，灵敏度高，重复性好，为今后测定并控制槟榔及其制成方剂中槟榔碱的含量提供参考。
参考文献
[1] 柯铭清.中草药有效成分理化与药理特性[M].长沙：湖南科学技术出版社，1992：426.
[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：2005年一版[S].北京：化学工业出版社，2005：254.
[3] 林励，徐鸿华，邓沛峰，等.槟榔中槟榔碱含量的薄层扫描测定[J].中国中药杂志，1992，17（8）：491-492.
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[6] 陈妤，闫晓楠.藿香正气软胶囊中槟榔碱的限量检查方法研究[J].天津药学，2017，29（5）：21-23.