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摘 要 系统性硬化症是一种复杂的自身免疫性疾病，其病因目前尚不清晰。近年来的研究发现，表观遗传因素参与了多种复杂疾病的发病过程。表观遗传因素由于同时受到遗传和环境因素的影响，可更深入地解释疾病发病相关机制。本文介绍系统性硬化症表观遗传学研究进展。
关键词 系统性硬化症 表观遗传学 DNA甲基化
中图分类号：R593.25 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2017）S1-0027-03
Research advances in the studies of systemic sclerosis epigenetics*
PU Weilin**， GUO Shicheng， CHEN Sidi， WANG Jiucun***（School of Life Sciences， Fudan University， Shanghai 200438， China）
ABSTRACT Systemic sclerosis （SSc） is a kind of complex autoimmune disease with different manifestations. The pathogenesis of SSc remains unknown. Multiple studies have revealed that the epigenetic factors are involved in the pathogenesis of many complex diseases. Meanwhile， the pathogenesis of SSc can be deeply understood by the study of the epigenomic status of individuals because it can be influenced by both genetic and environmental factors. This paper summarizes the advances in the studies of SSc epigenetics till now.
KEY WORDS sytemic sclerosis； epigenetics； DNA methylation
系统性硬化症（sytemic sclerosis， SSc）是一种病因不明的复杂的自身免疫性疾病。通过应用候选基因研究到全基因组关联研究等多类遗传学分析方法，目前已发现大量的遗传易感因素，但对疾病易感性的贡献仍处在较低水平。近年来的研究发现，表观遗传因素参与了SSc等自身免疫性疾病的发病过程。表观遗传因素同时受到遗传和环境因素的影响，是遗传和环境在疾病发生中的交互接口，可驱动具有特定遗传倾向的个体发生自身免疫性疾病。因此，表观遗传修饰可在某些方面更深入地解释疾病发生及进展的过程。本文介绍表观遗传现象（包括DNA甲基化、组蛋白修饰和miRNA等）在SSc发病、进展及其诊断、预后中的作用。
1 DNA甲基化
表观遗传修饰异常已被证实是复杂疾病发病机制中的重要组成部分，作为表观遗传修饰中被研究得最为透彻的DNA甲基化首先被联想到在SSc的易感性或致病中可能起着重要作用。虽然DNA甲基化在SSc中的研究数有限，但国际上的SSc研究团队基本上运用了各类前沿技术以获取SSc甲基化谱式的特征。2012年Jiang等[1]发现，SSc患者CD4+ T细胞中基因TNFSF7启动子区的去甲基化可促进CD70的高表达，进而影响SSc的免疫反应。CD4+ T细胞中CD11a调控序列的低甲基化可使CD11a过表达，并介导SSc发生过程中的免疫应答异常及纤维化发生[2]。此外，对女性SSc患者，CD4+ T细胞非活化的X染色体上基因CD40L的低甲基化所导致的CD40L表达增高可能是SSc在女性中高发的一个重要原因[3]。2014年Dees等[4]发现，基因DKK1和SFRP1启动子区的异常甲基化参与了SSc中Wnt信号传导通路异常的发生。2015年Altorok等[5]采用methylation450K全基因组甲基化芯片对配对的6组SSc患者和健康者的皮肤成纤维细胞进行异常甲基化分析，在弥漫性SSc（diffuse cutaneous systemic sclerosis， dcSSc）和局限性SSc（limited cutaneous systemic sclerosis， lcSSc）患者的皮肤成纤维细胞中分别鉴定出2 710和1 021个与健康者有显著差异的甲基化位点。在所有有差异的甲基化位点中，异常低甲基化位点数远远超过高甲基化位点数，其中在dcSSc和lcSSc患者的皮肤成纤维细胞中，异常甲基化位点中分别有61%和90%为低甲基化位点。此外，Altorok还观察到了大量SSc亚型特异性的异常甲基化位点。在dcSSc和lcSSc患者的皮肤成纤维细胞中均异常的甲基化位点数仅203个，涉及118个低甲基化和6个高甲基化基因，其中共同低甲基化基因包括ITGA9、ADAM12、COL23A1、COL4A2、MYO1E、RUNX1、RUNX2和RUNX3等，且低甲基化位点多位于基因的body区和UTR区。基于差异甲基化基因的异常信号传导通路分析显示，细胞外基质受体的相互作用及黏着斑系统发生了异常，此与前期的大量研究结果相吻合。
Lei等[6]采用全基因组甲基化水平定量评估技术对中国的10例SSc患者和12例健康者CD4+ T细胞的全基因组甲基化水平以及DNA甲基化系统相关基因表达进行了评估，发现SSc患者的DNA甲基化转移酶-1、甲基化结合蛋白-3和甲基化结合蛋白-4的表达显著降低，并观察到甲基化结合蛋白-4的表达水平与SSc患者全基因组的DNA甲基化水平显著相关。此外，SSc患者CD4+ T细胞的全基因组甲基化水平显著低于健康者，与在肿瘤基因组中的现象一致。全基因组甲基化水平对SSc特异性的甲基化谱式的揭示有助于促进SSc的早期診断、进展预测及其治疗手段的发展，因此笔者等近期也通过高通量甲基化芯片技术对SSc患者的CD4+和CD8+ T细胞进行了甲基化水平研究，发现SSc患者有多个与Ⅰ型干扰素相关的基因同时呈现低甲基化和高表达状态，提示Ⅰ型干扰素相关信号传导通路可能与SSc的发生相关。尽管上述全基因组水平研究已为SSc的甲基化组学提供了大量数据，但高覆盖率和高分辨率的SSc全基因组甲基化谱式尚未完成，SSc基因组中各种功能原件的精确甲基化谱式也有待进一步的研究。 2 组蛋白修饰
Wang等[7]以SSc患者的B细胞为模型研究了SSc患者全基因组水平的组蛋白修饰变化情况，发现SSc患者的B细胞在全基因组水平呈异常的组蛋白H4高乙酰化和组蛋白H3中赖氨酸9低甲基化状态，同时发现基因JHDM2A显著高表达并伴组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase， HDAC）2、HDAC7和UV39H2低表达。临床观察发现，全基因组组蛋白H4乙酰化与疾病活动性正相关，HDAC2的表达与皮肤厚度负相关。因此，全基因组水平组蛋白修饰的变化可能与SSc的多种临床表型密切相关。
对SSc患者和健康者成纤维细胞中基因FLI1启动子区组蛋白H3和H4乙酰化水平的检测结果显示，SSc患者成纤维细胞中的组蛋白H3和H4呈显著低乙酰化状态[8]。而组蛋白去乙酰化是靶基因表达受抑制的标志，可增强FLI1与DNA的相互作用，使染色质结构变得紧密、不利于转录，从而导致FLI1的低表达，进而使得细胞外基质基因的表达增高。此研究还发现，HDAC1和HDAC6在成纤维细胞中均高表达，与组蛋白H3和H4的低乙酰化状态相符。由此可见，FLI1的组蛋白去乙酰化与SSc的发生、发展相关。
基于在成纤维细胞中存在组蛋白乙酰化异常现象，研究者开始尝试使用HDAC抑制剂如曲古抑菌素A（已被广泛用于脊髓增生异常治疗）来进行治疗。曲古抑菌素A能够抑制SSc动物模型皮肤成纤维细胞中Ⅰ型胶原的表达[8]并减少成纤维细胞数[9]，减少皮肤纤维化动物模型中胶原、细胞外基质和纤连蛋白的累积[10]。有研究显示，曲古抑菌素A的这种效应是通过抑制HDAC7的表达、进而抑制胶原基因COL1A1和COL3A1等的表达而实现的[9，11]。上述各研究表明，组蛋白乙酰化水平变化可能在SSc发病中起着重要作用，而组蛋白乙酰化调控因子则有用于治疗SSc的潜力。
3 miRNA
由于miRNA对多种生理功能具有重要的调控作用，且miRNA的异常与多种疾病的发病均有非常重要的关联，因此对SSc的研究也涉及到对miRNA的研究。Makino等[12]在miRNA层面对SSc小鼠模型的胶原沉积及组织纤维化进行了研究，发现在dcSSc和lcSSc小鼠模型中均存在let-7a的低表达现象。进一步研究发现，过表达的let-7a可抑制Ⅲ型胶原蛋白的表达活性，从而减缓SSc小鼠模型的纤维化进程。Honda等[13]的研究发现，miR-150的低表达可促进Ⅰ型胶原蛋白的过表达。Maurer等[14]的研究发现，SSc患者的miR-29a呈显著低表达状态。miR-29a与SSc患者细胞外基质胶原的沉积和组织纤维化密切相关，可直接降低Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的表达。此外，β-转化生长因子、血小板源性生长因子B和白介素-4等均可降低miR-29的表达。因此，miR-29a有望成为SSc治疗药物的作用靶点。另有研究发现，miR-142在SSc患者血浆游离成分中的水平显著增高，且与疾病严重程度显著相关，提示miR-142有望用作SSc的诊断或辅助诊断标志物[15]。
4 结语
SSc的发病可能是在长期的风险环境暴露下通过改变表观基因（DNA甲基化、组蛋白修饰和miRNA等）并结合特定易感基因共同作用的结果。因此，对SSc致病因素的研究应采取同时结合表观遗传学和遗传学的研究策略，对SSc相关的易感基因变异，包括单核苷酸多态性、拷贝数变异、DNA甲基化和组蛋白修饰等，展开多组学联合关联分析，以促进对SSc的发病机制有更深入的认识，建立有效的SSc發病预测模型及治疗策略。
参考文献
[1] Jiang H， Xiao R， Lian X， et al. Demethylation of TNFSF7 contributes to CD70 overexpression in CD4+ T cells from patients with systemic sclerosis [J]. Clin Immunol， 2012， 143（1）： 39-44.
[2] Wang Y， Shu Y， Xiao Y， et al. Hypomethylation and overexpression of ITGAL（CD11a） in CD4+ T cells in systemic sclerosis [J/OL]. Clin Epigenetics， 2014， 6（1）： 25 [2017-01-17]. https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/ PMC4237764/pdf/13148_2014_Article_89.pdf.
[1] Lian X， Xiao R， Hu X， et al. DNA demethylation of CD40l in CD4+ T cells from women with systemic sclerosis： a possible explanation for female susceptibility [J]. Arthritis Rheum， 2012， 64（7）： 2338-2345.
[2] Dees C， Schlottmann I， Funke R， et al. The Wnt antagonists DKK1 and SFRP1 are downregulated by promoter hypermethylation in systemic sclerosis [J]. Ann Rheum Dis， 2014， 73（6）： 1232-1239.
[3] Altorok N， Tsou PS， Coit P， et al. Genome-wide DNA methylation analysis in dermal fibroblasts from patients with diffuse and limited systemic sclerosis reveals common and subset-specific DNA methylation aberrancies [J]. Ann Rheum Dis， 2015， 74（8）： 1612-1620. [4] Lei W， Luo Y， Lei W， et al. Abnormal DNA methylation in CD4+ T cells from patients with systemic lupus erythematosus， systemic sclerosis， and dermatomyositis [J]. Scand J Rheumatol， 2009， 38（5）： 369-374.
[5] Wang Y， Yang Y， Luo Y， et al. Aberrant histone modification in peripheral blood B cells from patients with systemic sclerosis [J]. Clin Immunol， 2013， 149（1）： 46-54.
[6] Wang Y， Fan PS， Kahaleh B. Association between enhanced type I collagen expression and epigenetic repression of the FLI1 gene in scleroderma fibroblasts[J]. Arthritis Rheum， 2006， 54（7）： 2271-2279.
[7] Hemmatazad H， Rodrigues HM， Maurer B， et al. Histone deacetylase 7， a potential target for the antifibrotic treatment of systemic sclerosis [J]. Arthritis Rheum， 2009， 60（5）： 1519-1529.
[8] Huber LC， Distler JH， Moritz F， et al. Trichostatin A prevents the accumulation of extracellular matrix in a mouse model of bleomycin-induced skin fibrosis [J]. Arthritis Rheum， 2007， 56（8）： 2755-2764.
[9] Broen JC， Radstake TR， Rossato M. The role of genetics and epigenetics in the pathogenesis of systemic sclerosis [J]. Nat Rev Rheumatol， 2014， 10（11）： 671-681.
[10] Makino K， Jinnin M， Hirano A， et al. The downregulation of microRNA let-7a contributes to the excessive expression of type I collagen in systemic and localized scleroderma [J]. J Immunol， 2013， 190（8）： 3905-3915.
[11] Honda N， Jinnin M， Kira-Etoh T， et al. miR-150 down-regulation contributes to the constitutive type I collagen overexpression in scleroderma dermal fibroblasts via the induction of integrin beta3 [J]. Am J Pathol， 2013， 182（1）： 206-216.
[12] Maurer B， Stanczyk J， Jüngel A， et al. MicroRNA-29， a key regulator of collagen expression in systemic sclerosis [J]. Arthritis Rheum， 2010， 62（6）： 1733-1743.
[13] Makino K， Jinnin M， Kajihara I， et al. Circulating miR-142-3p levels in patients with systemic sclerosis [J]. Clin Exp Dermatol， 2012， 37（1）： 34-39.
关键词 系统性硬化症 表观遗传学 DNA甲基化
中图分类号：R593.25 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2017）S1-0027-03
Research advances in the studies of systemic sclerosis epigenetics*
PU Weilin**， GUO Shicheng， CHEN Sidi， WANG Jiucun***（School of Life Sciences， Fudan University， Shanghai 200438， China）
ABSTRACT Systemic sclerosis （SSc） is a kind of complex autoimmune disease with different manifestations. The pathogenesis of SSc remains unknown. Multiple studies have revealed that the epigenetic factors are involved in the pathogenesis of many complex diseases. Meanwhile， the pathogenesis of SSc can be deeply understood by the study of the epigenomic status of individuals because it can be influenced by both genetic and environmental factors. This paper summarizes the advances in the studies of SSc epigenetics till now.
KEY WORDS sytemic sclerosis； epigenetics； DNA methylation
系统性硬化症（sytemic sclerosis， SSc）是一种病因不明的复杂的自身免疫性疾病。通过应用候选基因研究到全基因组关联研究等多类遗传学分析方法，目前已发现大量的遗传易感因素，但对疾病易感性的贡献仍处在较低水平。近年来的研究发现，表观遗传因素参与了SSc等自身免疫性疾病的发病过程。表观遗传因素同时受到遗传和环境因素的影响，是遗传和环境在疾病发生中的交互接口，可驱动具有特定遗传倾向的个体发生自身免疫性疾病。因此，表观遗传修饰可在某些方面更深入地解释疾病发生及进展的过程。本文介绍表观遗传现象（包括DNA甲基化、组蛋白修饰和miRNA等）在SSc发病、进展及其诊断、预后中的作用。
1 DNA甲基化
表观遗传修饰异常已被证实是复杂疾病发病机制中的重要组成部分，作为表观遗传修饰中被研究得最为透彻的DNA甲基化首先被联想到在SSc的易感性或致病中可能起着重要作用。虽然DNA甲基化在SSc中的研究数有限，但国际上的SSc研究团队基本上运用了各类前沿技术以获取SSc甲基化谱式的特征。2012年Jiang等[1]发现，SSc患者CD4+ T细胞中基因TNFSF7启动子区的去甲基化可促进CD70的高表达，进而影响SSc的免疫反应。CD4+ T细胞中CD11a调控序列的低甲基化可使CD11a过表达，并介导SSc发生过程中的免疫应答异常及纤维化发生[2]。此外，对女性SSc患者，CD4+ T细胞非活化的X染色体上基因CD40L的低甲基化所导致的CD40L表达增高可能是SSc在女性中高发的一个重要原因[3]。2014年Dees等[4]发现，基因DKK1和SFRP1启动子区的异常甲基化参与了SSc中Wnt信号传导通路异常的发生。2015年Altorok等[5]采用methylation450K全基因组甲基化芯片对配对的6组SSc患者和健康者的皮肤成纤维细胞进行异常甲基化分析，在弥漫性SSc（diffuse cutaneous systemic sclerosis， dcSSc）和局限性SSc（limited cutaneous systemic sclerosis， lcSSc）患者的皮肤成纤维细胞中分别鉴定出2 710和1 021个与健康者有显著差异的甲基化位点。在所有有差异的甲基化位点中，异常低甲基化位点数远远超过高甲基化位点数，其中在dcSSc和lcSSc患者的皮肤成纤维细胞中，异常甲基化位点中分别有61%和90%为低甲基化位点。此外，Altorok还观察到了大量SSc亚型特异性的异常甲基化位点。在dcSSc和lcSSc患者的皮肤成纤维细胞中均异常的甲基化位点数仅203个，涉及118个低甲基化和6个高甲基化基因，其中共同低甲基化基因包括ITGA9、ADAM12、COL23A1、COL4A2、MYO1E、RUNX1、RUNX2和RUNX3等，且低甲基化位点多位于基因的body区和UTR区。基于差异甲基化基因的异常信号传导通路分析显示，细胞外基质受体的相互作用及黏着斑系统发生了异常，此与前期的大量研究结果相吻合。
Lei等[6]采用全基因组甲基化水平定量评估技术对中国的10例SSc患者和12例健康者CD4+ T细胞的全基因组甲基化水平以及DNA甲基化系统相关基因表达进行了评估，发现SSc患者的DNA甲基化转移酶-1、甲基化结合蛋白-3和甲基化结合蛋白-4的表达显著降低，并观察到甲基化结合蛋白-4的表达水平与SSc患者全基因组的DNA甲基化水平显著相关。此外，SSc患者CD4+ T细胞的全基因组甲基化水平显著低于健康者，与在肿瘤基因组中的现象一致。全基因组甲基化水平对SSc特异性的甲基化谱式的揭示有助于促进SSc的早期診断、进展预测及其治疗手段的发展，因此笔者等近期也通过高通量甲基化芯片技术对SSc患者的CD4+和CD8+ T细胞进行了甲基化水平研究，发现SSc患者有多个与Ⅰ型干扰素相关的基因同时呈现低甲基化和高表达状态，提示Ⅰ型干扰素相关信号传导通路可能与SSc的发生相关。尽管上述全基因组水平研究已为SSc的甲基化组学提供了大量数据，但高覆盖率和高分辨率的SSc全基因组甲基化谱式尚未完成，SSc基因组中各种功能原件的精确甲基化谱式也有待进一步的研究。 2 组蛋白修饰
Wang等[7]以SSc患者的B细胞为模型研究了SSc患者全基因组水平的组蛋白修饰变化情况，发现SSc患者的B细胞在全基因组水平呈异常的组蛋白H4高乙酰化和组蛋白H3中赖氨酸9低甲基化状态，同时发现基因JHDM2A显著高表达并伴组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase， HDAC）2、HDAC7和UV39H2低表达。临床观察发现，全基因组组蛋白H4乙酰化与疾病活动性正相关，HDAC2的表达与皮肤厚度负相关。因此，全基因组水平组蛋白修饰的变化可能与SSc的多种临床表型密切相关。
对SSc患者和健康者成纤维细胞中基因FLI1启动子区组蛋白H3和H4乙酰化水平的检测结果显示，SSc患者成纤维细胞中的组蛋白H3和H4呈显著低乙酰化状态[8]。而组蛋白去乙酰化是靶基因表达受抑制的标志，可增强FLI1与DNA的相互作用，使染色质结构变得紧密、不利于转录，从而导致FLI1的低表达，进而使得细胞外基质基因的表达增高。此研究还发现，HDAC1和HDAC6在成纤维细胞中均高表达，与组蛋白H3和H4的低乙酰化状态相符。由此可见，FLI1的组蛋白去乙酰化与SSc的发生、发展相关。
基于在成纤维细胞中存在组蛋白乙酰化异常现象，研究者开始尝试使用HDAC抑制剂如曲古抑菌素A（已被广泛用于脊髓增生异常治疗）来进行治疗。曲古抑菌素A能够抑制SSc动物模型皮肤成纤维细胞中Ⅰ型胶原的表达[8]并减少成纤维细胞数[9]，减少皮肤纤维化动物模型中胶原、细胞外基质和纤连蛋白的累积[10]。有研究显示，曲古抑菌素A的这种效应是通过抑制HDAC7的表达、进而抑制胶原基因COL1A1和COL3A1等的表达而实现的[9，11]。上述各研究表明，组蛋白乙酰化水平变化可能在SSc发病中起着重要作用，而组蛋白乙酰化调控因子则有用于治疗SSc的潜力。
3 miRNA
由于miRNA对多种生理功能具有重要的调控作用，且miRNA的异常与多种疾病的发病均有非常重要的关联，因此对SSc的研究也涉及到对miRNA的研究。Makino等[12]在miRNA层面对SSc小鼠模型的胶原沉积及组织纤维化进行了研究，发现在dcSSc和lcSSc小鼠模型中均存在let-7a的低表达现象。进一步研究发现，过表达的let-7a可抑制Ⅲ型胶原蛋白的表达活性，从而减缓SSc小鼠模型的纤维化进程。Honda等[13]的研究发现，miR-150的低表达可促进Ⅰ型胶原蛋白的过表达。Maurer等[14]的研究发现，SSc患者的miR-29a呈显著低表达状态。miR-29a与SSc患者细胞外基质胶原的沉积和组织纤维化密切相关，可直接降低Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的表达。此外，β-转化生长因子、血小板源性生长因子B和白介素-4等均可降低miR-29的表达。因此，miR-29a有望成为SSc治疗药物的作用靶点。另有研究发现，miR-142在SSc患者血浆游离成分中的水平显著增高，且与疾病严重程度显著相关，提示miR-142有望用作SSc的诊断或辅助诊断标志物[15]。
4 结语
SSc的发病可能是在长期的风险环境暴露下通过改变表观基因（DNA甲基化、组蛋白修饰和miRNA等）并结合特定易感基因共同作用的结果。因此，对SSc致病因素的研究应采取同时结合表观遗传学和遗传学的研究策略，对SSc相关的易感基因变异，包括单核苷酸多态性、拷贝数变异、DNA甲基化和组蛋白修饰等，展开多组学联合关联分析，以促进对SSc的发病机制有更深入的认识，建立有效的SSc發病预测模型及治疗策略。
参考文献
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