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【内容摘要】：本文筛选得到可以耐受高浓度木糖的菌株，再经过复筛选出一株高产木糖醇的酵母菌株Y-7，用篩选出的最优发酵产木糖醇菌利用甜菜渣水解液发酵木糖醇，通过微生物发酵水解液检测水解效果，确定最佳的水解条件，进一步提高目的菌株的木糖醇产率和转化率。
【关键词】：木糖 木糖醇 菌株 水解 发酵
一、产木糖醇酵母菌株的筛选
木糖醇，又称为戊五醇，是一种五碳糖，分子式为C5H12O5，分子量152.15，分子结构式如图1所示。
图1木糖醇的分子结构式
木糖醇的外观为白色结晶体或结晶性粉末，味甜，易溶于水，熔点为92～96℃，沸点216℃，具有独特的生理功能和化学性质，能够长时间储藏和保存，在医药、食品、化工等领域有着广泛的应用。由于木糖醇热量低，甜度与蔗糖相近，在代谢的过程中不需要胰岛素的参与就能透过细胞壁被人体吸收，而且可以促进胰岛素的分泌，是糖尿病患者理想的糖代谢用药。人们在使用蔗糖或者含有蔗糖的食品后，口腔中残余的蔗糖会在细菌的作用下产生酸性物质，从而导致矿物质流失，造成龋齿的产生，使用木糖醇则能减少酸性物质对牙齿的伤害，从而达到防止龋齿的作用。不仅如此，木糖醇还具有多元醇的特性，还可应用于化妆品、造纸、国防等工业。随着对木糖醇特性研究的深入，木糖醇的应用领域也在逐步扩大，在生产、生活中扮演着重要的角色。
木糖醇虽存在于水果、蔬菜当中，但数量极少，仅0.014%-0.09%，无法满足人们对木糖醇日益增长的需要。目前工业上主要通过化学加氢法生产木糖醇，这种方法，成本高，耗能大，对环境污染也比较大。相比较之下，微生物发酵法以其操作简便、成本低廉、能源消耗少、环境污染小等优点受到人们的青睐，引起人们的关注，成为研究的热点。
木糖醇的生成需要合适的原材料，甜菜渣、甘蔗渣等农业废弃物可以通过生物技术转化为木糖醇，基本原理为将农业废弃物中所含的多缩戊糖经稀酸水解后得到的主要产物是木糖的水解液，然后利用微生物发酵水解液中的木糖可得木糖醇。本文通过对生物发酵木糖醇关键菌株的研究，选择木糖醇转化率较高的酵母菌株并用筛选出的最优发酵产木糖醇菌利用甜菜渣水解液发酵木糖醇，以提高木糖醇的转化率。
（一）试验材料
1 菌株
试样全部为黑龙江产甜菜渣。
2 培养基
富集培养基：木糖300g/L，NaCl 2 g/L；平板筛选培养基：木糖100g/L，酵母膏3g/L，琼脂20 g/L；复筛培养基：木糖50g/L，酵母膏5g/L，玉米浆10 mL/L，pH自然。
3 试剂
所用试剂均为国产分析纯。
（二）试验方法
将甜菜渣碾碎，取样5 g，加入到50 mL无菌水中，振荡10 min，静置后取5 mL上清液接种到富集培养基中，180 r/min摇床培养7 d。将富集后的培养液进行适当稀释，涂布在平板筛选培养基上，30℃培养3～5 d，挑取酵母状菌落转接到斜面。斜面在30℃培养2～3 d斜面菌种培养成熟后，转接到三角瓶复筛培养基，定时取样分析各菌株木糖醇产生情况。用纸层析检测挑选有木糖醇斑点的菌株并用HPLC检测发酵清液中的木糖残余量和木糖醇产量，筛选木糖利用率高、木糖醇产量高的菌株。
（三）结果
经富集培养、平板筛选，共挑取耐高浓度木糖的酵母菌株300株、经摇瓶发酵、纸层析检测，共得到80株有木糖醇斑点的菌株，经HPLC分析，其中木糖/木糖醇转化率达50%以上的菌株有36株。经过多次摇瓶发酵复筛转化率稳定在60%左右的有8株，结果见表1。
表1木糖醇产生菌株复筛结果
经过研究发现，菌株Y-7的木糖利用率和木糖醇转化率都比较高，可以作为生物转化木糖醇的出发菌株作为下一步研究的对象。
二、甜菜渣半纤维素水解液发酵的研究
研究表明，植物纤维原料经过处理后，可转化为各种各样的产品，在石油化工、日用品生产等行业都可作为原料使用。目前世界各国对于这些富含纤维素、木质素和半纤维素的植物纤维的极少重视，大多是直接丢弃，这样一方面导致了环境污染，另一方面也造成了资源的浪费。以甜菜渣为例，大部分国家对于甜菜渣的使用，或者是作为动物饲料，或者是作为制浆造纸的原料，这两种方式都未能真正发挥甜菜渣的价值。我国每年甜菜渣的总产量超过7亿吨，利用率却不足5%。如果能够真正的发挥甜菜渣的价值，使甜菜渣变废为宝，对人类可持续发展有着重大意义。
甜菜渣中含有纤维素36.5%～38.6%，半纤维素38.0%～38.8%，木质素12.3%～17.6%，在稀酸水解的过程中，这三种物质降解生成如下物质：（1）纤维素水解生成葡萄糖，葡萄糖在酸性条件下继续降解，生成5-羟甲基糠醛（HMF）、甲酸和乙酰基丙酸等：（2）半纤维素水解生成木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖和少量的乙酸，由半纤维素水解生成的单糖在酸性条件下继续降解生成5-羟甲基糠醛、甲酸和乙酰基丙酸等物质；（3）木质素也会发生少量降解，主要产物为多种单环芳香族类化合物。水解过程中产生的物质成分复杂，如乙酸、糠醛、四氢呋喃、酚类等毒性物质会抑制水解液的发酵性能。为了提高水解液的发酵性能，半纤维素酸水解液发酵前一般需经脱毒预处理。
（一）试验材料
甜菜渣购自黑龙江省双鸭市集贤县，秋季甜菜采收脱糖后粉碎到80目，烘干备用。将粉碎后的甜菜渣与酸性离子水以1：10的比例混合，在密闭的不锈钢管中，分别在140、160、180℃油浴加热10min，处理完的混合物过滤后得到的液体为半纤维素水解液。
（二）试验方法
取半纤维素水解液1ml，10000r/min离心5min，取上清液用0.22μm水系微孔滤膜过滤，进行适当稀释后，使用高效液相色谱仪进行分析，测定水解液与发酵液的成分，采用示差折光检测器检测木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖醇和醋酸，使用紫外检测器检测糠醛和四氢呋喃。
（三）试验结果
（1）水解温度对于水解液的色值和水解液中木糖和聚糖的含量有着直接的影响，水解问题越高，水解的色值也会逐渐升高，水解液中木糖和聚糖的含量则会降低。水温太高，会导致木糖被分解，部分甜菜渣碳化，造成水解液颜色加深，不利于后期处理。水解温度为140℃时，水解液中木糖和聚糖的含量最高，最适宜后期处理。
（2）经过对石灰中和、石灰过中和、活性炭吸附、离子交换树脂吸附这四种脱毒方法的对比发现，离子交换树脂吸附法对水解液中醋酸的去除效果最好；活性炭吸附法次之，但活性炭吸附脱毒对水解液中木糖损失较大，不利于下一步木糖发酵生产木糖醇；石灰中和、石灰过中和对水解液抑制物的脱毒效果并不十分理想。
（3）在发酵罐中采用分阶段改变通气速率发酵生产木糖醇，能明显提高木糖醇效率.在发酵前期通气速率大，有利于发酵培养基中发酵抑制物和葡萄糖的消耗，促进酵母菌的生长，缩短发酵周期；在发酵后期，采用相对低的通气速率，有利于发酵液中木糖醇的积累。
三、结束语
木糖醇的应用范围日益广泛，利用微生物法生产木糖醇成为学术界研究的热点问题，通过本文的试验，确定了最佳的水解条件，进一步提高目的菌株的木糖醇产率和转化率，使产品质量更加安全可靠。
【参考文献】
[1]赵寿经，侯琨，粱彦龙，徐立新，钱延春.产木糖醇菌株的筛选及发酵条件优化[J].吉林大学学报（工学版）.2010（03）
[2]方祥年，黄炜，夏黎明.半纤维素水解液中抑制物对发酵生产木糖醇的影响[J].浙江大学学报（工学版）.2005（04）
[3]王海洪，孙晓锋，张广成，吴耀国.玉米芯半纤维素制备木糖醇的研究[J].应用化工.2010（02）
[4]张爱民，张道宽，张增博，王惠晶.微生物法生产木糖醇的研究进展[J].食品研究与开发.2012（04）
【作者简介】
王涛，男，1980年，黑龙江省佳木斯市，讲师；研究方向：微生物发酵技术黑龙江农业职业技术学院。
【关键词】：木糖 木糖醇 菌株 水解 发酵
一、产木糖醇酵母菌株的筛选
木糖醇，又称为戊五醇，是一种五碳糖，分子式为C5H12O5，分子量152.15，分子结构式如图1所示。
图1木糖醇的分子结构式
木糖醇的外观为白色结晶体或结晶性粉末，味甜，易溶于水，熔点为92～96℃，沸点216℃，具有独特的生理功能和化学性质，能够长时间储藏和保存，在医药、食品、化工等领域有着广泛的应用。由于木糖醇热量低，甜度与蔗糖相近，在代谢的过程中不需要胰岛素的参与就能透过细胞壁被人体吸收，而且可以促进胰岛素的分泌，是糖尿病患者理想的糖代谢用药。人们在使用蔗糖或者含有蔗糖的食品后，口腔中残余的蔗糖会在细菌的作用下产生酸性物质，从而导致矿物质流失，造成龋齿的产生，使用木糖醇则能减少酸性物质对牙齿的伤害，从而达到防止龋齿的作用。不仅如此，木糖醇还具有多元醇的特性，还可应用于化妆品、造纸、国防等工业。随着对木糖醇特性研究的深入，木糖醇的应用领域也在逐步扩大，在生产、生活中扮演着重要的角色。
木糖醇虽存在于水果、蔬菜当中，但数量极少，仅0.014%-0.09%，无法满足人们对木糖醇日益增长的需要。目前工业上主要通过化学加氢法生产木糖醇，这种方法，成本高，耗能大，对环境污染也比较大。相比较之下，微生物发酵法以其操作简便、成本低廉、能源消耗少、环境污染小等优点受到人们的青睐，引起人们的关注，成为研究的热点。
木糖醇的生成需要合适的原材料，甜菜渣、甘蔗渣等农业废弃物可以通过生物技术转化为木糖醇，基本原理为将农业废弃物中所含的多缩戊糖经稀酸水解后得到的主要产物是木糖的水解液，然后利用微生物发酵水解液中的木糖可得木糖醇。本文通过对生物发酵木糖醇关键菌株的研究，选择木糖醇转化率较高的酵母菌株并用筛选出的最优发酵产木糖醇菌利用甜菜渣水解液发酵木糖醇，以提高木糖醇的转化率。
（一）试验材料
1 菌株
试样全部为黑龙江产甜菜渣。
2 培养基
富集培养基：木糖300g/L，NaCl 2 g/L；平板筛选培养基：木糖100g/L，酵母膏3g/L，琼脂20 g/L；复筛培养基：木糖50g/L，酵母膏5g/L，玉米浆10 mL/L，pH自然。
3 试剂
所用试剂均为国产分析纯。
（二）试验方法
将甜菜渣碾碎，取样5 g，加入到50 mL无菌水中，振荡10 min，静置后取5 mL上清液接种到富集培养基中，180 r/min摇床培养7 d。将富集后的培养液进行适当稀释，涂布在平板筛选培养基上，30℃培养3～5 d，挑取酵母状菌落转接到斜面。斜面在30℃培养2～3 d斜面菌种培养成熟后，转接到三角瓶复筛培养基，定时取样分析各菌株木糖醇产生情况。用纸层析检测挑选有木糖醇斑点的菌株并用HPLC检测发酵清液中的木糖残余量和木糖醇产量，筛选木糖利用率高、木糖醇产量高的菌株。
（三）结果
经富集培养、平板筛选，共挑取耐高浓度木糖的酵母菌株300株、经摇瓶发酵、纸层析检测，共得到80株有木糖醇斑点的菌株，经HPLC分析，其中木糖/木糖醇转化率达50%以上的菌株有36株。经过多次摇瓶发酵复筛转化率稳定在60%左右的有8株，结果见表1。
表1木糖醇产生菌株复筛结果
经过研究发现，菌株Y-7的木糖利用率和木糖醇转化率都比较高，可以作为生物转化木糖醇的出发菌株作为下一步研究的对象。
二、甜菜渣半纤维素水解液发酵的研究
研究表明，植物纤维原料经过处理后，可转化为各种各样的产品，在石油化工、日用品生产等行业都可作为原料使用。目前世界各国对于这些富含纤维素、木质素和半纤维素的植物纤维的极少重视，大多是直接丢弃，这样一方面导致了环境污染，另一方面也造成了资源的浪费。以甜菜渣为例，大部分国家对于甜菜渣的使用，或者是作为动物饲料，或者是作为制浆造纸的原料，这两种方式都未能真正发挥甜菜渣的价值。我国每年甜菜渣的总产量超过7亿吨，利用率却不足5%。如果能够真正的发挥甜菜渣的价值，使甜菜渣变废为宝，对人类可持续发展有着重大意义。
甜菜渣中含有纤维素36.5%～38.6%，半纤维素38.0%～38.8%，木质素12.3%～17.6%，在稀酸水解的过程中，这三种物质降解生成如下物质：（1）纤维素水解生成葡萄糖，葡萄糖在酸性条件下继续降解，生成5-羟甲基糠醛（HMF）、甲酸和乙酰基丙酸等：（2）半纤维素水解生成木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖和少量的乙酸，由半纤维素水解生成的单糖在酸性条件下继续降解生成5-羟甲基糠醛、甲酸和乙酰基丙酸等物质；（3）木质素也会发生少量降解，主要产物为多种单环芳香族类化合物。水解过程中产生的物质成分复杂，如乙酸、糠醛、四氢呋喃、酚类等毒性物质会抑制水解液的发酵性能。为了提高水解液的发酵性能，半纤维素酸水解液发酵前一般需经脱毒预处理。
（一）试验材料
甜菜渣购自黑龙江省双鸭市集贤县，秋季甜菜采收脱糖后粉碎到80目，烘干备用。将粉碎后的甜菜渣与酸性离子水以1：10的比例混合，在密闭的不锈钢管中，分别在140、160、180℃油浴加热10min，处理完的混合物过滤后得到的液体为半纤维素水解液。
（二）试验方法
取半纤维素水解液1ml，10000r/min离心5min，取上清液用0.22μm水系微孔滤膜过滤，进行适当稀释后，使用高效液相色谱仪进行分析，测定水解液与发酵液的成分，采用示差折光检测器检测木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖醇和醋酸，使用紫外检测器检测糠醛和四氢呋喃。
（三）试验结果
（1）水解温度对于水解液的色值和水解液中木糖和聚糖的含量有着直接的影响，水解问题越高，水解的色值也会逐渐升高，水解液中木糖和聚糖的含量则会降低。水温太高，会导致木糖被分解，部分甜菜渣碳化，造成水解液颜色加深，不利于后期处理。水解温度为140℃时，水解液中木糖和聚糖的含量最高，最适宜后期处理。
（2）经过对石灰中和、石灰过中和、活性炭吸附、离子交换树脂吸附这四种脱毒方法的对比发现，离子交换树脂吸附法对水解液中醋酸的去除效果最好；活性炭吸附法次之，但活性炭吸附脱毒对水解液中木糖损失较大，不利于下一步木糖发酵生产木糖醇；石灰中和、石灰过中和对水解液抑制物的脱毒效果并不十分理想。
（3）在发酵罐中采用分阶段改变通气速率发酵生产木糖醇，能明显提高木糖醇效率.在发酵前期通气速率大，有利于发酵培养基中发酵抑制物和葡萄糖的消耗，促进酵母菌的生长，缩短发酵周期；在发酵后期，采用相对低的通气速率，有利于发酵液中木糖醇的积累。
三、结束语
木糖醇的应用范围日益广泛，利用微生物法生产木糖醇成为学术界研究的热点问题，通过本文的试验，确定了最佳的水解条件，进一步提高目的菌株的木糖醇产率和转化率，使产品质量更加安全可靠。
【参考文献】
[1]赵寿经，侯琨，粱彦龙，徐立新，钱延春.产木糖醇菌株的筛选及发酵条件优化[J].吉林大学学报（工学版）.2010（03）
[2]方祥年，黄炜，夏黎明.半纤维素水解液中抑制物对发酵生产木糖醇的影响[J].浙江大学学报（工学版）.2005（04）
[3]王海洪，孙晓锋，张广成，吴耀国.玉米芯半纤维素制备木糖醇的研究[J].应用化工.2010（02）
[4]张爱民，张道宽，张增博，王惠晶.微生物法生产木糖醇的研究进展[J].食品研究与开发.2012（04）
【作者简介】
王涛，男，1980年，黑龙江省佳木斯市，讲师；研究方向：微生物发酵技术黑龙江农业职业技术学院。