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【摘要】目的：利用小鼠支气管哮喘模型探讨中药芪味理肺汤方剂（简称芪肺汤）的疗效及其与糖皮质激素联用的协同作用机制。方法：雄性BALB/c小鼠随机分组后建立支气管哮喘模型，分别采用地塞米松、芪肺汤、地塞米松+芪肺汤联用进行胃饲给药治疗，并设立相关对照组。处理1周后，通过肺组织病理染色、支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞分类计数评价炎症治疗效果，通过ELISA检测BALF细胞因子的表达。结果：对比哮喘对照组，三个治疗组均出现肺部炎症部分减轻及BALF细胞计数的减少，其中联用组表现为中性粒细胞及嗜酸性细胞计数的共同下降。结论：芪味理肺汤方剂与糖皮质激素联合运用能协同抑制嗜酸性细胞及中性粒细胞激活，对激素非敏感哮喘治疗可能具有较大意义。
【关键词】芪味理肺汤；哮喘；气道炎症；中性粒细胞；糖皮质激素
Abstract：Objective： To investigate the synergistic therapeutic effect of Qiweileifeitang （Qi） with glucocorticoid for allergic inflammation in bronchial asthma mouse models. Methods： 50 mice were randomly divided into for 5 groups for dexamethasone or Qi or combined treatment，the pathological changes of lung tissue and cell counts in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） were used to evaluate the therapeutic efficacy. Results： The lung pathological changes and cell counts in BALF most significantly decreased in the combined group comparing to other control groups. Conclusion： Combination of Qi and glucocorticoid may be a better strategy for glucocorticoid insensitive asthma therapy as it can both inhibit neutrophils and eosinophils activation.
Keywords：Qiweilifeitang；asthma；airway inflammation；neutrophils；glucocorticoid
【中圖分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2016）03-0005-02
支气管哮喘（asthma，简称哮喘）形成的经典病理机制是由气道的炎性因子和炎性细胞的活化 [1]。目前研究证实，糖皮质激素可以有效地影响Th2相关的嗜酸性细胞的分化及功能，但是仍然存在部分患者对糖皮质激素治疗不敏感，影响临床疗效[2]。近期研究证实了Th17细胞及中性粒细胞相关的炎症反应在哮喘气道炎症中具有重要作用，并可能是部分哮喘患者糖皮质激素不敏感的重要机制[3]。围绕Th17细胞调控进行的哮喘治疗可能是当前糖皮质激素疗法的有益补充。芪味理肺汤方剂是依据多年哮喘治疗临床经验形成的中药复方，此前研究报道，芪味理肺汤对支气管哮喘模型大鼠血清清除氧自由基能力具有较大影响 [4]，但其机制尚未完全阐明，尤其是其对于糖皮质激素非敏感性哮喘的作用尚未明确报道。
1. 材料和方法
1.1 动物 SPF级雄性BALB/c小鼠50只，6-8周龄，将小鼠随机分成5组， 每组10只， 分别为正常对照组（A组）、哮喘造模+盐水胃饲组（B组）、地塞米松治疗组（C组）、芪肺汤治疗组（D组）及地塞米松+芪肺汤治疗组（E组），第二军医大学动物中心提供，SPF级常规喂养。
1.2 药品试剂 卵蛋白干粉（OVA），Alfa公司，批号：A16951；氢氧化铝，美国Sigma公司，批号：A4682；芪味理肺汤；地塞米松粉剂，Sigma公司，批号：D4902。
1.3 哮喘动物模型制备及给药 根据文献制备支气管哮喘模型小鼠[2] 。芪肺汤按20ml/kg体重每天1次胃饲，每ml含有1g生药，其他组给予胃饲等量生理盐水作为对照。地塞米松给药为胃饲，药物浓度为150μg/mL，3mL/d。各组均为造模成功后连续给药7天。
1.4 取材 第29天放血处死小鼠，切开气管， 用生理盐水1ml灌洗小鼠肺组织， 收集支气管肺泡灌洗液（BALF）， 分离的上清液-80℃保存待测。取4%多聚甲醛固定的右肺中叶进行病理切片观察。
1.5 病理切片观察 采用石蜡包埋及HE染色法进行组织切片，并行图像观察。
1.6 统计学处理 所有数据用（ x±s）表示， 采用SPSS19.0版统计软件进行数据处理，所有定量数据经过方差齐性检验和正态性检验后，对多组数据进行方差分析，对两组比较采用t检验， 以P<0.01为差异有显著性。
2. 结果
2.1 一般情况 正常组无阳性症状，哮喘造模+盐水胃饲组（以下简称哮喘组）小鼠外观可出现呼吸急促、咳嗽喘息、排尿排便增多、烦躁不安等症状，严重者反应迟钝、可闻及痰鸣音。各治疗组哮喘症状均有所改善，尤其呼吸急促改善明显，地塞米松+芪肺汤组改善最为明显。
2.2 肺组织病理结果 如图1，正常组未见炎性细胞浸润，肺泡、支气管黏膜上皮结构完整清晰，支气管无痉挛；与正常组比较，哮喘组肺组织炎性细胞浸润，支气管黏膜上皮细胞排列紊乱，肺泡间隔增厚等典型支气管哮喘病理表现，治疗后芪肺汤组和地塞米松组与哮喘组比较，支气管黏膜上皮细胞排列较为整齐，炎性细胞浸润减轻，地塞米松+芪肺汤组明显优于其他治疗组。
2.3 BALF细胞总数及分类计数结果 如图2所示，与正常组相比，哮喘组BALF涂片细胞总计数及淋巴细胞（Lym）总数显著升高（P<0.01）；而三种治疗组中相比哮喘组均出现明显降低。与正常组相比，哮喘组BALF涂片嗜酸性粒细胞（Eos）计数显著升高（P<0.01）；而三种治疗方案中，地塞米松治疗组及地塞米松+芪肺汤联合治疗组Eos均明显低于哮喘组（P<0.01），芪肺汤下降较为不明显。与正常组相比，哮喘组BALF涂片中性粒细胞（Neu）计数显著升高（P<0.01）；而相对哮喘组，地塞米松治疗组Neu变化不显著，而芪肺汤治疗组BALF中Neu计数显著低于哮喘组（P<0.01），而且，地塞米松+芪肺汤联合治疗组中Neu计数显著低于地塞米松治疗组（P<0.01）。
3. 讨论
此前哮喘常用的糖皮质激素疗法主要针对嗜酸性粒细胞相关反应进行改善，但是对中性粒细胞干预不明显，这也是文献中报道的糖皮质激素难治性哮喘的主要病理原因之一。本研究证实了芪味理肺汤可以改善支气管哮喘的气道炎症和中性粒细胞激活，减低了相关的炎症反应。而芪味理肺汤与糖皮质激素联合应用可以同时抑制嗜酸性粒细胞及中性粒细胞激活，从而更好地消除和调控气道炎症反应，因此可能在治疗机理上具有协同作用，其临床价值值得在实践中进行深入研究。
参考文献
[1] 于宗学， 李强， 胡东明. 中医治疗在支气管哮喘治疗中的应用概述[J]. 中国中医急症， 2014， 23（3）：489-490.
[2] 彭芬， 黄华， 钱炜. 糖皮质激素对哮喘患儿的临床疗效及作用机制研究[J]. 中国临床药理学杂志， 2016， 32（1）：3-5.
[3] 王彦， 王斌， 陈华萍，等. 中性粒细胞性哮喘临床特征分析[J]. 中国呼吸与危重监护杂志， 2011， 10（4）：317-320.
[4] 李春雷， 史琦， 阎玥， 李四维， 张玲，孔艳华等.芪味理肺汤对哮喘大鼠血清清除氧自由基能力的影响[J]. 中华中医药杂志， 2015（5）：1644-1647.
通讯作者：朱唯芳
【关键词】芪味理肺汤；哮喘；气道炎症；中性粒细胞；糖皮质激素
Abstract：Objective： To investigate the synergistic therapeutic effect of Qiweileifeitang （Qi） with glucocorticoid for allergic inflammation in bronchial asthma mouse models. Methods： 50 mice were randomly divided into for 5 groups for dexamethasone or Qi or combined treatment，the pathological changes of lung tissue and cell counts in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） were used to evaluate the therapeutic efficacy. Results： The lung pathological changes and cell counts in BALF most significantly decreased in the combined group comparing to other control groups. Conclusion： Combination of Qi and glucocorticoid may be a better strategy for glucocorticoid insensitive asthma therapy as it can both inhibit neutrophils and eosinophils activation.
Keywords：Qiweilifeitang；asthma；airway inflammation；neutrophils；glucocorticoid
【中圖分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2016）03-0005-02
支气管哮喘（asthma，简称哮喘）形成的经典病理机制是由气道的炎性因子和炎性细胞的活化 [1]。目前研究证实，糖皮质激素可以有效地影响Th2相关的嗜酸性细胞的分化及功能，但是仍然存在部分患者对糖皮质激素治疗不敏感，影响临床疗效[2]。近期研究证实了Th17细胞及中性粒细胞相关的炎症反应在哮喘气道炎症中具有重要作用，并可能是部分哮喘患者糖皮质激素不敏感的重要机制[3]。围绕Th17细胞调控进行的哮喘治疗可能是当前糖皮质激素疗法的有益补充。芪味理肺汤方剂是依据多年哮喘治疗临床经验形成的中药复方，此前研究报道，芪味理肺汤对支气管哮喘模型大鼠血清清除氧自由基能力具有较大影响 [4]，但其机制尚未完全阐明，尤其是其对于糖皮质激素非敏感性哮喘的作用尚未明确报道。
1. 材料和方法
1.1 动物 SPF级雄性BALB/c小鼠50只，6-8周龄，将小鼠随机分成5组， 每组10只， 分别为正常对照组（A组）、哮喘造模+盐水胃饲组（B组）、地塞米松治疗组（C组）、芪肺汤治疗组（D组）及地塞米松+芪肺汤治疗组（E组），第二军医大学动物中心提供，SPF级常规喂养。
1.2 药品试剂 卵蛋白干粉（OVA），Alfa公司，批号：A16951；氢氧化铝，美国Sigma公司，批号：A4682；芪味理肺汤；地塞米松粉剂，Sigma公司，批号：D4902。
1.3 哮喘动物模型制备及给药 根据文献制备支气管哮喘模型小鼠[2] 。芪肺汤按20ml/kg体重每天1次胃饲，每ml含有1g生药，其他组给予胃饲等量生理盐水作为对照。地塞米松给药为胃饲，药物浓度为150μg/mL，3mL/d。各组均为造模成功后连续给药7天。
1.4 取材 第29天放血处死小鼠，切开气管， 用生理盐水1ml灌洗小鼠肺组织， 收集支气管肺泡灌洗液（BALF）， 分离的上清液-80℃保存待测。取4%多聚甲醛固定的右肺中叶进行病理切片观察。
1.5 病理切片观察 采用石蜡包埋及HE染色法进行组织切片，并行图像观察。
1.6 统计学处理 所有数据用（ x±s）表示， 采用SPSS19.0版统计软件进行数据处理，所有定量数据经过方差齐性检验和正态性检验后，对多组数据进行方差分析，对两组比较采用t检验， 以P<0.01为差异有显著性。
2. 结果
2.1 一般情况 正常组无阳性症状，哮喘造模+盐水胃饲组（以下简称哮喘组）小鼠外观可出现呼吸急促、咳嗽喘息、排尿排便增多、烦躁不安等症状，严重者反应迟钝、可闻及痰鸣音。各治疗组哮喘症状均有所改善，尤其呼吸急促改善明显，地塞米松+芪肺汤组改善最为明显。
2.2 肺组织病理结果 如图1，正常组未见炎性细胞浸润，肺泡、支气管黏膜上皮结构完整清晰，支气管无痉挛；与正常组比较，哮喘组肺组织炎性细胞浸润，支气管黏膜上皮细胞排列紊乱，肺泡间隔增厚等典型支气管哮喘病理表现，治疗后芪肺汤组和地塞米松组与哮喘组比较，支气管黏膜上皮细胞排列较为整齐，炎性细胞浸润减轻，地塞米松+芪肺汤组明显优于其他治疗组。
2.3 BALF细胞总数及分类计数结果 如图2所示，与正常组相比，哮喘组BALF涂片细胞总计数及淋巴细胞（Lym）总数显著升高（P<0.01）；而三种治疗组中相比哮喘组均出现明显降低。与正常组相比，哮喘组BALF涂片嗜酸性粒细胞（Eos）计数显著升高（P<0.01）；而三种治疗方案中，地塞米松治疗组及地塞米松+芪肺汤联合治疗组Eos均明显低于哮喘组（P<0.01），芪肺汤下降较为不明显。与正常组相比，哮喘组BALF涂片中性粒细胞（Neu）计数显著升高（P<0.01）；而相对哮喘组，地塞米松治疗组Neu变化不显著，而芪肺汤治疗组BALF中Neu计数显著低于哮喘组（P<0.01），而且，地塞米松+芪肺汤联合治疗组中Neu计数显著低于地塞米松治疗组（P<0.01）。
3. 讨论
此前哮喘常用的糖皮质激素疗法主要针对嗜酸性粒细胞相关反应进行改善，但是对中性粒细胞干预不明显，这也是文献中报道的糖皮质激素难治性哮喘的主要病理原因之一。本研究证实了芪味理肺汤可以改善支气管哮喘的气道炎症和中性粒细胞激活，减低了相关的炎症反应。而芪味理肺汤与糖皮质激素联合应用可以同时抑制嗜酸性粒细胞及中性粒细胞激活，从而更好地消除和调控气道炎症反应，因此可能在治疗机理上具有协同作用，其临床价值值得在实践中进行深入研究。
参考文献
[1] 于宗学， 李强， 胡东明. 中医治疗在支气管哮喘治疗中的应用概述[J]. 中国中医急症， 2014， 23（3）：489-490.
[2] 彭芬， 黄华， 钱炜. 糖皮质激素对哮喘患儿的临床疗效及作用机制研究[J]. 中国临床药理学杂志， 2016， 32（1）：3-5.
[3] 王彦， 王斌， 陈华萍，等. 中性粒细胞性哮喘临床特征分析[J]. 中国呼吸与危重监护杂志， 2011， 10（4）：317-320.
[4] 李春雷， 史琦， 阎玥， 李四维， 张玲，孔艳华等.芪味理肺汤对哮喘大鼠血清清除氧自由基能力的影响[J]. 中华中医药杂志， 2015（5）：1644-1647.
通讯作者：朱唯芳