【摘 要】
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目的 构建鲍曼不动杆菌ATCC17978外膜蛋白Omp33-36基因缺陷株. 方法 pAT04质粒电穿孔鲍曼不动杆菌ATCC 17978所得ATCC17978-pAT04经IPTG诱导后用甘油法制备电穿孔用感受态细
【机 构】
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江苏大学检验医学研究所免疫研究室,江苏镇江212013
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目的 构建鲍曼不动杆菌ATCC17978外膜蛋白Omp33-36基因缺陷株. 方法 pAT04质粒电穿孔鲍曼不动杆菌ATCC 17978所得ATCC17978-pAT04经IPTG诱导后用甘油法制备电穿孔用感受态细菌.以ATCC17978基因组为模板PCR扩增Omp33-36的上下游基因,以pKD4质粒为模板扩增卡那霉素抗性基因1 477 bp片段,并以上述3种PCR产物割胶回收的混合物作为融合PCR模板,扩增Omp33-36同源臂卡那霉素抗性盒DNA片段(2 111bp);以此融合PCR产物为模板巢式PCR扩增同源臂卡那霉素抗性盒DNA片段(1 977 bp)并电穿孔至感受态ATCC17978-pAT04;经卡那霉素筛选及PCR鉴定得到同源重组菌株△Omp∷FRT-kanR (pAT04),去除pAT04质粒,得到菌株△Omp∷FRT-kanR.将pAT03质粒电穿孔感受态Omp∷FRT-kanR细菌,得到△Omp∷FRT-kanR (pAT03)菌株,再经IPTG诱导表达FLP重组酶去除卡那霉素抗性基因,得到△Omp∷FRT(pAT03)菌株,进一步去除pAT03质粒后得到敲除Omp33-36基因的目的菌株△Omp∷ FRT并测序鉴定.超速离心法提取细菌OMVs并进行SDS-PAGE;E-test测定ATCC17978野生株和Omp33-36敲除株对碳青霉烯类的最低抑菌浓度(MIC)值. 结果 成功构建鲍曼不动杆菌Omp33-36敲除株△Omp∷FRT,测序表明敲除的Omp33-36基因座位被FRT序列及卡那霉素扩增引物序列所替代.从Omp33-36敲除株△Omp∷FRT提取的OMVs经SDS-PAGE电泳显示,与野生株相比约33 ku蛋白组分几尽缺失.敲除株△Omp∷FRT对美罗培南的MIC值高于野生株. 结论 利用RecAb系统成功敲除鲍曼不动杆菌外膜蛋白Omp33-36基因,建立了Omp33-36缺陷株,其对美罗培南的耐受性增高.
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