【摘 要】
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C型溶菌酶(Chicken-type lysozyme)作为草鱼(Ctenopharyngodon idella)内源性免疫系统中的重要蛋白质类免疫因子,能在草鱼抵抗病原微生物侵染的过程中发挥重要作用,亦是开发绿色饲料添加剂或生物类抗菌剂的佳选.本研究通过逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)克隆草鱼C型溶菌酶的编码基因“CilyC”,再经二次PCR在其5\'和3\'端添加各种必需位点.将“CilyC”与表达载体“pPICZαA”连接后转入工程菌毕赤酵母(
【机 构】
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上海海洋大学食品学院,上海 201306
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C型溶菌酶(Chicken-type lysozyme)作为草鱼(Ctenopharyngodon idella)内源性免疫系统中的重要蛋白质类免疫因子,能在草鱼抵抗病原微生物侵染的过程中发挥重要作用,亦是开发绿色饲料添加剂或生物类抗菌剂的佳选.本研究通过逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)克隆草鱼C型溶菌酶的编码基因“CilyC”,再经二次PCR在其5\'和3\'端添加各种必需位点.将“CilyC”与表达载体“pPICZαA”连接后转入工程菌毕赤酵母(Pichia pastoris)X-33中,获得重组菌株“X-33/pPICZαA-CilyC”.经含高浓度博莱霉素的培养基筛选得到高拷贝重组菌株后,对其最适蛋白质表达条件进行优化和筛选.通过镍离子亲和层析法纯化重组菌株的表达产物,并对纯化产物进行Western blot分析和LC-MS/MS质谱鉴定.此外,经平板涂布法和最小抑菌浓度(MIC)法考察重组菌株表达产物的抑菌活性.结果表明:X-33/pPICZαA-CilyC在29℃、250 r/min、1％ 甲醇浓度、96 h的发酵培养条件下,能产13.7 mg/L的重组蛋白;该重组蛋白经结构鉴定为预期分子量14.5 kD的CilyC蛋白.抑菌试验结果显示:重组CilyC具有明显的抗革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilisi)、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)以及革兰氏阴性的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和沙门氏菌(Salmonella)的生物学活性.本研究构建的重组毕赤酵母菌株“X-33/pPICZαA-CilyC”能有效合成草鱼C型溶菌酶,为鱼类来源C型溶菌酶的大规模制备奠定了良好基础.
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