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摘要：目的 通过观察中药复方强心复脉颗粒对损伤兔窦房结组织缝隙连接蛋白45（Cx45）表达的影响，探讨其治疗病态窦房结综合征的可能机制。方法 30只大耳白兔随机分为正常组，模型组，阿托品组，强心复脉颗粒高、中、低剂量组（以下简称高、中、低剂量组），每组5只。除正常组外，余各组均采用甲醛加压注射渗透法建立兔窦房结组织损伤模型，待模型稳定后各用药组灌胃给药7 d，免疫组织化学方法检测各组兔窦房结组织Cx45表达的变化。结果 与正常组相比，模型组兔窦房结组织Cx45表达量显著降低（P<0.01）；与模型组相比，高剂量组家兔窦房结组织Cx45表达量显著升高，且明显优于中、低剂量组及阿托品组（P<0.05或P<0.01）；阿托品及中、低剂量组之间无明显差异（P>0.05）。结论 窦房结组织损伤后Cx45表达量明显减少，强心复脉颗粒能上调损伤窦房结组织Cx45的表达，可能是其治疗病态窦房结综合征的分子机制之一。
关键词：强心复脉颗粒；窦房结；缝隙连接蛋白45；兔
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）04-0044-03
窦房结是心脏的正常起搏点，正常节律性冲动的发源地，是心脏传导系统的重要组成部分，其电活动通过细胞间缝隙连接（gap junction，GJ）向心房扩布。GJ是细胞间特化的连接方式，属于功能性连接，为相邻细胞间提供了一个低阻抗的电耦联通道。缝隙连接蛋白（Connexin，Cx）是构成GJ的分子基础，对窦房结起搏和传导功能起着重要作用。本研究在建立兔窦房结组织损伤模型的基础上，通过观察强心复脉颗粒对损伤兔窦房结组织Cx45表达的影响，探讨其治疗病态窦房结综合征的分子学依据，同时希望通过药物干预Cx作为治疗病窦新的靶点，从而为临床防治病态窦房结综合征提供新的理论依据。
1 实验材料
1.1 动物
健康成年大耳白兔30只，体质量2.3～2.8 kg，雌雄不拘，中国中医科学院广安门医院实验动物中心提供，许可证号：SCXK（京）2005-0009。
1.2 主要药物、试剂及仪器
3%戊巴比妥钠溶液（北京三博远志生物技术有限责任公司，进口分装，批号018k0754），20%甲醛溶液（国药集团化学试剂有限公司，批号20091015），4%多聚甲醛（索莱宝生物科技有限公司，批号20091210），青霉素钠（华北制药，规格：80万U，批号Y0909210），强心复脉颗粒（湖南九典制药有限公司，批号20100113），盐酸阿托品片（山东仁和堂药业有限公司，批号090402），兔Cx45单克隆抗体，即用型SABC免疫组化染色试剂盒，DAB显色试剂盒（武汉博士德生物有限公司）。DF-4A型心脏电生理刺激仪（东方电子仪器厂），BL-420F生物机能实验测定仪（成都泰盟科技有限公司），倒置荧光显微镜（Olympus Ⅸ-70）。
2 实验方法
2.1 窦房结组织损伤模型的建立
以自制电极三通管甲醛加压注射渗透法制造兔病态窦房结综合征模型。3%戊巴比妥钠30 mg/kg耳缘静脉麻醉大耳白兔后，背位固定于兔台上，兔四肢皮下插入电极连接BL-420F生物机能实验仪，实验仪与电脑相连，记录体表心电图。胸前区备皮，沿胸骨右缘2～3 mm处纵行开胸，逐层分离组织，钳断右侧第三肋，经纵膈打开心包（避免损伤右胸膜），暴露右心耳。以自制窦房结定位电极标头置于窦房结区域[1-2]，电极末端连接心电图v1导联，测定窦房结电图，当出现窦房结区域电图特征时（深大负向P波及相对较小的QRS波群[3]），于电极三通管另一端连接注射器，推注20%甲醛溶液0.01～0.02 mL。当心率下降30%～50%，或出现窦性停搏、窦房阻滞、结性逸搏等心律失常时停止浸润甲醛，并连续观察2 h，心率稳定后为成功病态窦房结综合征模型，以青霉素钠生理盐水冲洗胸腔，逐层关胸，返回动物房精心饲养备用。
2.2 动物分组、给药及取材
30只大耳白兔随机分为正常组、模型组、阿托品组及强心复脉高、中、低剂量组（以下简称高、中、低剂量组），每组5只。除正常组外，余各组均采用甲醛加压注射渗透法建立兔窦房结组织损伤模型，以青霉素钠生理盐水80万U/d抗感染，连续注射3 d，使模型稳定。于第4日起开始给药。给药剂量采用国际标准，按兔（以3 kg兔体表面积为准）与人（以60 kg成人体表面积为准）体表面积折合换算[4]，成人每日需用浸膏量12.4 g （相当于原药材84 g）。折算实验兔高剂量组给予强心复脉颗粒6.44 g/（kg·d），相当于成人临床用量的12倍；中剂量组给予强心复脉颗粒3.22 g/（kg·d），相当于成人临床用量的6倍；低剂量组给予强心复脉颗粒1.61 g/（kg·d），相当于成人临床用量的3倍。阿托品组予以盐酸阿托品0.36 mg/（kg·d），相当于成人临床用量的12倍。各组药物均配成悬浊液，每日早晚各1次灌胃给药。正常组、模型组均以等体积的生理盐水替代灌胃药物。常规饲养，给药7 d后行窦房结电生理功能检测，耳缘静脉注入空气栓塞致死，迅速取出心脏并用生理盐水冲洗，分离出右心耳及上下腔静脉，剪开上下腔静脉，于上腔静脉入口以下至从腔耳角向外下沿界嵴到下腔静脉口这一区域切取窦房结组织[1]，保留界嵴及上下腔静脉根部。
2.3 免疫组织化学染色
将组织浸泡于4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋、切片。行免疫组织化学SABC法染色，切片二甲苯、梯度乙醇脱蜡至水。滴加3%H2O2室温孵育10 min灭活内源性过氧化物，PBS液冲洗，微波热修复抗原，冷却至室温，PBS液冲洗，滴加5%BSA封闭液，室温孵育20 min，滴加适当稀释的一抗，4 ℃过夜，PBS液冲洗，滴加生物素标记的二抗（生物素化羊抗兔IgG），37 ℃孵育20 min， PBS液冲洗，滴加试剂SABC，37 ℃孵育20 min，PBS液冲洗，DAB显色，蒸馏水洗涤，苏木素复染，脱水封片，显微镜观察，阳性表达呈棕黄色或黄色。采用Image-Pro plus6.0图像分析软件对染色结果进行分析并测量Cx45表达的累积光密度（IOD）值。 3 统计学方法
采用SPSS17.0软件进行数据分析，所有数据均采用—x±s表示，组间比较数据符合正态者做多组间方差分析（ANOVA），两两比较采用LSD法，数据不符合正态者做非参数检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
4 结果
正常组兔窦房结组织均可见Cx45表达，主要位于窦房结中央P、T细胞膜表面，呈点状、细条状及簇状分布，向周围界嵴处逐渐减少。模型组与正常组相比，Cx45表达明显减弱且分布紊乱，表明甲醛渗透对Cx45表达有一定影响，与文献报道一致[5]。
各给药组Cx45表达较模型组有所上调。正常组Cx45的IOD值明显大于模型组，且2组间比较差异有统计学意义（P<0.01），说明本实验造模所采用的甲醛加压注射渗透法可行。各用药组与模型组相比IOD值差异有统计学意义（P<0.05），说明药物对损伤的窦房结组织有一定的保护作用，可提高Cx45蛋白的表达量。各用药组组间比较，中药高剂量组优于中、低剂量组及阿托品组（P<0.01），差异有统计学意义。中剂量组、低剂量组、阿托品组组间比较（P>0.05）。见表1。
5 讨论
病态窦房结综合征属中医“心悸”、“胸痹”、“眩晕”、“厥证”、“迟脉证”等范畴。强心复脉颗粒以人参、附子、三七为主药。其中附子入心肾二经，补火助阳；人参大补元气，复脉固脱，人参皂苷对机体各组织的RNA和蛋白质合成均有促进作用，人参茎叶总皂苷对兔实验性窦房结功能损伤则有保护作用[5]；人参与附子相伍，补气回阳、固本扶正，既可增强机体抵抗力又可升动阳气，温通血脉，从而使气血运行通畅，脉象得复；三七专走血分，功善行血活血，与参附相伍，共奏益阳活血、强心复脉之效。
在窦房结组织中，Cx主要有两个职能：①维持心脏正常节律；②将冲动传到心房且不受超激化的影响[6]。Cx45是窦房结中主要表达的Cx，其分布与密度的改变必然导致相应传导速度和各向异性传导发生改变，从而出现传导减慢及传导阻滞等现象，引起各种心律失常。周氏[7]通过模型研究发现窦房结组织急性损伤后Cx45的表达量明显减少，与电生理同步测量窦房结功能低下一致。表明窦房结组织损伤后，必将影响窦房结细胞间的特化连接，从而导致窦房结细胞之间的Cx45表达发生变化，引起细胞间电耦联与机械耦联异常使窦房结功能下降。本实验亦采用电生理方法测量建模后反映窦房结电生理功能的各项指标，结果表明，利用改进的甲醛加压注射渗透法建立的兔窦房结组织损伤模型窦房结功能显著降低，Cx45表达较正常组明显减少，两者一致，且与周氏实验结果基本相符，具有可重复性。
成功建立动物病态窦房结综合征模型是研究病态窦房结综合征的发病机制、病理生理变化及临床防治的基础与前提。本研究在传统甲醛湿敷建立病态窦房结综合征模型的基础上，改进实验方法，利用甲醛加压注射渗透法成功建立了窦房结组织损伤模型，并在此基础上通过药物干预，利用免疫组织化学方法检测窦房结细胞Cx45表达变化。研究结果表明甲醛加压注射渗透法能够使窦房结细胞缺血、缺氧，遭到破坏，所建立模型窦房结组织损伤改变与临床病态窦房结综合征病理特征相似。模型组Cx45表达量明显减少，强心复脉颗粒能够上调损伤后窦房结组织Cx45的表达，尤其是高剂量组对家兔窦房结组织Cx45表达量显著升高，从而增加细胞间电耦联与机械耦作用，改善窦房结传导功能，使心率提高，这可能是其治疗病态窦房结综合征的主要分子机制之一。本实验从基因分子水平着手，为中医药治疗病态窦房结综合征提供新的科学依据，对深层次挖掘名老中医经验的科学内涵具有重要的临床意义。
参考文献：
[1] MR Boyett， H Honjo， I Kodama. The sinoatrial node， a heterogeneous pacemaker structure[J]. Cardiovascular Res，2000， 47（4）：658-687.
[2] WK Bleeker， AJ Mackaay， M Masson-Pevet， et al. Functional and morphological organization of the rabbit sinus node[J]. Circ Res，1980，46：11-22.
[3] Cramer M， Robert J， Hariman M， et al. Electrograms from the canine sinoatrial pacemaker record in vitro in situ[J]. Am J Cardol，1978，42：939-946.
[4] 施新猷.现代医学实验动物学：实验动物用药量的确定及计算方法[M].北京：人民军医出版社，2000：332-334.
[5] 张卫萍.杨培君教授治疗病态窦房结综合征的经验总结[J].陕西中医学院学报，2001，24（3）：18-19.
[6] Jongsma HJ. Diversity of gap junctional proteins：dose it play a role in cardiac excitation[J]. Cardiovasc Electrophysiol，2000， 11：2008-2230.
[7] 周圣华，宋治远.兔窦房结组织急性损伤后缝隙连接蛋白CX45、CX43表达的研究[J].心肺血管病杂志，2005，24（2）：111-113.
（收稿日期：2011-05-26，编辑：华强）
关键词：强心复脉颗粒；窦房结；缝隙连接蛋白45；兔
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）04-0044-03
窦房结是心脏的正常起搏点，正常节律性冲动的发源地，是心脏传导系统的重要组成部分，其电活动通过细胞间缝隙连接（gap junction，GJ）向心房扩布。GJ是细胞间特化的连接方式，属于功能性连接，为相邻细胞间提供了一个低阻抗的电耦联通道。缝隙连接蛋白（Connexin，Cx）是构成GJ的分子基础，对窦房结起搏和传导功能起着重要作用。本研究在建立兔窦房结组织损伤模型的基础上，通过观察强心复脉颗粒对损伤兔窦房结组织Cx45表达的影响，探讨其治疗病态窦房结综合征的分子学依据，同时希望通过药物干预Cx作为治疗病窦新的靶点，从而为临床防治病态窦房结综合征提供新的理论依据。
1 实验材料
1.1 动物
健康成年大耳白兔30只，体质量2.3～2.8 kg，雌雄不拘，中国中医科学院广安门医院实验动物中心提供，许可证号：SCXK（京）2005-0009。
1.2 主要药物、试剂及仪器
3%戊巴比妥钠溶液（北京三博远志生物技术有限责任公司，进口分装，批号018k0754），20%甲醛溶液（国药集团化学试剂有限公司，批号20091015），4%多聚甲醛（索莱宝生物科技有限公司，批号20091210），青霉素钠（华北制药，规格：80万U，批号Y0909210），强心复脉颗粒（湖南九典制药有限公司，批号20100113），盐酸阿托品片（山东仁和堂药业有限公司，批号090402），兔Cx45单克隆抗体，即用型SABC免疫组化染色试剂盒，DAB显色试剂盒（武汉博士德生物有限公司）。DF-4A型心脏电生理刺激仪（东方电子仪器厂），BL-420F生物机能实验测定仪（成都泰盟科技有限公司），倒置荧光显微镜（Olympus Ⅸ-70）。
2 实验方法
2.1 窦房结组织损伤模型的建立
以自制电极三通管甲醛加压注射渗透法制造兔病态窦房结综合征模型。3%戊巴比妥钠30 mg/kg耳缘静脉麻醉大耳白兔后，背位固定于兔台上，兔四肢皮下插入电极连接BL-420F生物机能实验仪，实验仪与电脑相连，记录体表心电图。胸前区备皮，沿胸骨右缘2～3 mm处纵行开胸，逐层分离组织，钳断右侧第三肋，经纵膈打开心包（避免损伤右胸膜），暴露右心耳。以自制窦房结定位电极标头置于窦房结区域[1-2]，电极末端连接心电图v1导联，测定窦房结电图，当出现窦房结区域电图特征时（深大负向P波及相对较小的QRS波群[3]），于电极三通管另一端连接注射器，推注20%甲醛溶液0.01～0.02 mL。当心率下降30%～50%，或出现窦性停搏、窦房阻滞、结性逸搏等心律失常时停止浸润甲醛，并连续观察2 h，心率稳定后为成功病态窦房结综合征模型，以青霉素钠生理盐水冲洗胸腔，逐层关胸，返回动物房精心饲养备用。
2.2 动物分组、给药及取材
30只大耳白兔随机分为正常组、模型组、阿托品组及强心复脉高、中、低剂量组（以下简称高、中、低剂量组），每组5只。除正常组外，余各组均采用甲醛加压注射渗透法建立兔窦房结组织损伤模型，以青霉素钠生理盐水80万U/d抗感染，连续注射3 d，使模型稳定。于第4日起开始给药。给药剂量采用国际标准，按兔（以3 kg兔体表面积为准）与人（以60 kg成人体表面积为准）体表面积折合换算[4]，成人每日需用浸膏量12.4 g （相当于原药材84 g）。折算实验兔高剂量组给予强心复脉颗粒6.44 g/（kg·d），相当于成人临床用量的12倍；中剂量组给予强心复脉颗粒3.22 g/（kg·d），相当于成人临床用量的6倍；低剂量组给予强心复脉颗粒1.61 g/（kg·d），相当于成人临床用量的3倍。阿托品组予以盐酸阿托品0.36 mg/（kg·d），相当于成人临床用量的12倍。各组药物均配成悬浊液，每日早晚各1次灌胃给药。正常组、模型组均以等体积的生理盐水替代灌胃药物。常规饲养，给药7 d后行窦房结电生理功能检测，耳缘静脉注入空气栓塞致死，迅速取出心脏并用生理盐水冲洗，分离出右心耳及上下腔静脉，剪开上下腔静脉，于上腔静脉入口以下至从腔耳角向外下沿界嵴到下腔静脉口这一区域切取窦房结组织[1]，保留界嵴及上下腔静脉根部。
2.3 免疫组织化学染色
将组织浸泡于4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋、切片。行免疫组织化学SABC法染色，切片二甲苯、梯度乙醇脱蜡至水。滴加3%H2O2室温孵育10 min灭活内源性过氧化物，PBS液冲洗，微波热修复抗原，冷却至室温，PBS液冲洗，滴加5%BSA封闭液，室温孵育20 min，滴加适当稀释的一抗，4 ℃过夜，PBS液冲洗，滴加生物素标记的二抗（生物素化羊抗兔IgG），37 ℃孵育20 min， PBS液冲洗，滴加试剂SABC，37 ℃孵育20 min，PBS液冲洗，DAB显色，蒸馏水洗涤，苏木素复染，脱水封片，显微镜观察，阳性表达呈棕黄色或黄色。采用Image-Pro plus6.0图像分析软件对染色结果进行分析并测量Cx45表达的累积光密度（IOD）值。 3 统计学方法
采用SPSS17.0软件进行数据分析，所有数据均采用—x±s表示，组间比较数据符合正态者做多组间方差分析（ANOVA），两两比较采用LSD法，数据不符合正态者做非参数检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
4 结果
正常组兔窦房结组织均可见Cx45表达，主要位于窦房结中央P、T细胞膜表面，呈点状、细条状及簇状分布，向周围界嵴处逐渐减少。模型组与正常组相比，Cx45表达明显减弱且分布紊乱，表明甲醛渗透对Cx45表达有一定影响，与文献报道一致[5]。
各给药组Cx45表达较模型组有所上调。正常组Cx45的IOD值明显大于模型组，且2组间比较差异有统计学意义（P<0.01），说明本实验造模所采用的甲醛加压注射渗透法可行。各用药组与模型组相比IOD值差异有统计学意义（P<0.05），说明药物对损伤的窦房结组织有一定的保护作用，可提高Cx45蛋白的表达量。各用药组组间比较，中药高剂量组优于中、低剂量组及阿托品组（P<0.01），差异有统计学意义。中剂量组、低剂量组、阿托品组组间比较（P>0.05）。见表1。
5 讨论
病态窦房结综合征属中医“心悸”、“胸痹”、“眩晕”、“厥证”、“迟脉证”等范畴。强心复脉颗粒以人参、附子、三七为主药。其中附子入心肾二经，补火助阳；人参大补元气，复脉固脱，人参皂苷对机体各组织的RNA和蛋白质合成均有促进作用，人参茎叶总皂苷对兔实验性窦房结功能损伤则有保护作用[5]；人参与附子相伍，补气回阳、固本扶正，既可增强机体抵抗力又可升动阳气，温通血脉，从而使气血运行通畅，脉象得复；三七专走血分，功善行血活血，与参附相伍，共奏益阳活血、强心复脉之效。
在窦房结组织中，Cx主要有两个职能：①维持心脏正常节律；②将冲动传到心房且不受超激化的影响[6]。Cx45是窦房结中主要表达的Cx，其分布与密度的改变必然导致相应传导速度和各向异性传导发生改变，从而出现传导减慢及传导阻滞等现象，引起各种心律失常。周氏[7]通过模型研究发现窦房结组织急性损伤后Cx45的表达量明显减少，与电生理同步测量窦房结功能低下一致。表明窦房结组织损伤后，必将影响窦房结细胞间的特化连接，从而导致窦房结细胞之间的Cx45表达发生变化，引起细胞间电耦联与机械耦联异常使窦房结功能下降。本实验亦采用电生理方法测量建模后反映窦房结电生理功能的各项指标，结果表明，利用改进的甲醛加压注射渗透法建立的兔窦房结组织损伤模型窦房结功能显著降低，Cx45表达较正常组明显减少，两者一致，且与周氏实验结果基本相符，具有可重复性。
成功建立动物病态窦房结综合征模型是研究病态窦房结综合征的发病机制、病理生理变化及临床防治的基础与前提。本研究在传统甲醛湿敷建立病态窦房结综合征模型的基础上，改进实验方法，利用甲醛加压注射渗透法成功建立了窦房结组织损伤模型，并在此基础上通过药物干预，利用免疫组织化学方法检测窦房结细胞Cx45表达变化。研究结果表明甲醛加压注射渗透法能够使窦房结细胞缺血、缺氧，遭到破坏，所建立模型窦房结组织损伤改变与临床病态窦房结综合征病理特征相似。模型组Cx45表达量明显减少，强心复脉颗粒能够上调损伤后窦房结组织Cx45的表达，尤其是高剂量组对家兔窦房结组织Cx45表达量显著升高，从而增加细胞间电耦联与机械耦作用，改善窦房结传导功能，使心率提高，这可能是其治疗病态窦房结综合征的主要分子机制之一。本实验从基因分子水平着手，为中医药治疗病态窦房结综合征提供新的科学依据，对深层次挖掘名老中医经验的科学内涵具有重要的临床意义。
参考文献：
[1] MR Boyett， H Honjo， I Kodama. The sinoatrial node， a heterogeneous pacemaker structure[J]. Cardiovascular Res，2000， 47（4）：658-687.
[2] WK Bleeker， AJ Mackaay， M Masson-Pevet， et al. Functional and morphological organization of the rabbit sinus node[J]. Circ Res，1980，46：11-22.
[3] Cramer M， Robert J， Hariman M， et al. Electrograms from the canine sinoatrial pacemaker record in vitro in situ[J]. Am J Cardol，1978，42：939-946.
[4] 施新猷.现代医学实验动物学：实验动物用药量的确定及计算方法[M].北京：人民军医出版社，2000：332-334.
[5] 张卫萍.杨培君教授治疗病态窦房结综合征的经验总结[J].陕西中医学院学报，2001，24（3）：18-19.
[6] Jongsma HJ. Diversity of gap junctional proteins：dose it play a role in cardiac excitation[J]. Cardiovasc Electrophysiol，2000， 11：2008-2230.
[7] 周圣华，宋治远.兔窦房结组织急性损伤后缝隙连接蛋白CX45、CX43表达的研究[J].心肺血管病杂志，2005，24（2）：111-113.
（收稿日期：2011-05-26，编辑：华强）