【摘 要】
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目的在原核系统中克隆、表达并纯化巢蛋白(nestin),制备特异性nestin抗体,用于研究nestin在中枢神经系统发育中的生物学特性,探索神经发育及再生规律。方法采用RT-PCR方法由
【机 构】
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西安交通大学医学院神经科学研究中心,西安交通大学医学院环境与疾病相关基因教育部重点实验室,第二附属医院
【基金项目】
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国家自然科学基金(30300109,30170300)~~
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目的在原核系统中克隆、表达并纯化巢蛋白(nestin),制备特异性nestin抗体,用于研究nestin在中枢神经系统发育中的生物学特性,探索神经发育及再生规律。方法采用RT-PCR方法由人神经干细胞中获取nestin cDNA,与原核表达载体pQE30连接,构建重组载体pQE30-nestin。测序后,将重组质粒转入大肠杆菌M15,IPTG诱导表达His融合蛋白。Ni-NTA亲和层析柱纯化后,SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定。用此蛋白免疫BALB／c小鼠,获得抗血清。 Western blotting、ELISA和免疫组织化学分析鉴定获取的抗血清。结果成功由人神经干细胞中克隆nestin cDNA片段。 IPTG诱导重组质粒pQE30-nestin表达出一相对分子质量约25 000的His融合蛋白并被Ni-NTA成功纯化,Western blotting证明其确为nestin蛋白。动物免疫后,经Western blotting、ELISA和免疫组化鉴定,获得的抗血清可特异性结合重组nestin蛋白、发育期人及大鼠脑内的nestm蛋白。结论获得了重组人nestin蛋白,制备的抗血清不仅可识别重组 nestin蛋白,亦可识别人及大鼠脑组织内的nestin蛋白。
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