论文部分内容阅读
自2020年年初新型冠状病毒导致的肺炎在国内暴发以来，感染人数不断上升。2020年3月11日，世界卫生组织总干事谭德塞在日内瓦记者会上宣布，此次由新型冠状病毒导致的疫情具有大流行病的特征[1]。 截至2020年3月16日，各国累计确诊病例中，排名前四的国家为：中国81062例，意大利21270例，伊朗13938例，韩国8162例[2]。目前，我国感染新型冠状病毒的人数新增量在不断减少，但是对于其他国家来说，形势依然十分严峻。
3月4日，国家卫健委印发新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）[3]，此诊疗方案中提到，疑似病例的确诊标准之一为实时荧光定量RT-PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，反转录·聚合酶链反应）检测新型冠状病毒核酸阳性。但是，这个被称为“金标准”的实时荧光定量RT-PCR检测技术在临床应用中却被报道存在假阴性，即被检测者已经感染了新型冠状病毒，但是检测不出病毒核酸。
实时荧光定量RT-PCR，很多没有医学、生物背景的朋友初次听到这个名字也许会十分疑惑，什么是核酸？什么是实时荧光定量RT-PCR？为什么被称为“金标准”的RT-PCR检测技术在临床实践过程中并不能100%检测出新型冠状病毒？下面为大家一一解答。
什么是核酸
核酸，简单来讲就是遗传物质，一种能够传递遗传信息的物质，通常由亲代传给子代，能够控制子代的生长发育。一般来说，不同的生物所携带的遗传信息都是独特的（同卵双胞胎除外）。遗传物质分为DNA（脱氧核糖核酸）和RNA（核糖核酸），大多数病毒的遗传物质都为RNA。以新型冠状病毒为例，此病毒的核酸就是RNA，其RNA由四种不同核糖核苷酸排列组成，因为排列的顺序以及所含不同种类核糖核苷酸的数量不同，使得新型冠状病毒的RNA与其他RNA病毒的RNA有所不同。实时荧光定量RT-PCR技术就是利用新型冠状病毒所具有的独特RNA，对其进行特异性检测。
实时荧光定量RT-PCR技术原理
实时荧光定量RT-PCR是将实时荧光定量PCR技术和RT-PCR技术相结合[4]，首先，采用RT-PCR技术，使新型冠状病毒的RNA逆转录DNA;然后，用DNA作为模板，采用实时荧光定量PCR技术对DNA进行扩增[5];同时，使用探针（目前的试剂盒主要使用的是Taq Man探针1）与对应的核酸片段进行结合，结合在核酸片段上的探针在特殊的外切酶活性作用下发生水解，产生荧光。随着DNA片段的不断扩增，荧光信号不断增强，DNA的数量以荧光信号的形式间接地被相关仪器记录。最后，根据荧光信号与扩增循环数之间的关系可以绘制出实时扩增曲线，从而检测出标本中是否含有新型冠状病毒核酸[6-7]。
通俗来讲，新型冠状病毒与实时荧光定量RT-PCR的关系就是，新型冠状病毒的RNA可以看成它的身份证，而实时荧光定量PCR技术中的引物并不能直接识别这种身份证上的信息，所以当我们从患者标本中获取到RNA时，首先需要采用RT-PCR对身份证的信息进行翻译转换，将病毒的RNA逆转录为DNA，使其病毒信息能够被实时荧光定量PCR的引物和探针识别。但是，我们从原始标本获得的RNA太少，低于了仪器检测的下限，所以，我们首先要对获得的信息进行复制扩增，在扩增的同时将这些信息打上标签（探针），而被打上的标签在一定作用下（特定酶水解作用）可以发出荧光，被仪器检测到，这样就可以通过检测病毒核酸的存在来间接证实病毒的存在。
“金标准”为何“失效”
根据上述原理可知，新型冠状病毒的核酸检测与很多因素相关。采用实时荧光定量RT-PCR技术而得到假阴性结果（即已经是感染者，但检测不出病毒核酸）的原因主要有两点[8]。
第一个原因是原始标本中的RNA含量太低，低于了实时荧光定量PCR的检测下限，使得病毒核酸无法得到有效扩增，从而无法产生足够的荧光信号而导致检测结果为阴性。
这与标本的取材、患者感染的时间以及取到标本后检测的时间都有关系。受病毒感染机制影响，不同组织来源的标本病毒核酸含量差异较大。研究显示，新型冠状病毒更趋向于结合肺泡上皮细胞，因此，理论上来说，感染者下呼吸道标本病毒核酸检测准确率会比上呼吸道标本的更高。患者感染的时间也是一个重要因素。病毒在侵入人体细胞之后需要时间去繁殖，如果是早期患者的标本，病毒刚刚入侵细胞，没有足够的时间复制，细胞中也就没有那么多病毒核酸。此外，这次感染的人数众多，人力、物力都十分有限，很多患者标本在取到后都来不及及时检测，在等待检测的时间里，病毒RNA会有一定程度的分解，这也导致了原始病毒的核酸过低。
第二个原因是在原理中提到的探针结合，在实时荧光定量PCR技术中，探针能够特异性结合到病毒核酸片段上，在酶的参与作用下发出荧光信号，从而间接反映病毒核酸的存在。但是，如果探针结合的病毒核酸部位发生变异，可能会影响探针的结合效率，导致荧光信号检测不到，而出现假阴性的结果。
此外，假阴性的发生也跟此技术本身的灵敏度有关，此次新型冠状病毒肺炎暴发得太突然，目前，应用于临床的试剂盒并不成熟，灵敏度还不够。
多方面改善假阴性问题
针对上述假阴性问题，国家正从各方面努力进行改善。比如，标本质量不好，国家卫健委公布的第六版新型冠状病毒肺炎诊疗方案[9]指出需要全面规范采样，在这之后，公开报道的假阴性患者数量明显减少;比如，试剂盒不够灵敏，国内各个医院、研究機构正在不断努力，已经研发出了一些新的核酸检测试剂盒。四川大学华西医院成功研发出了多款新型冠状病毒检测试剂盒，有两项已经进入临床验证阶段。2020年3月，新型冠状病毒引起的肺炎在中国已经初步得到了控制，相信在不久的将来，一切都会恢复正常。
参考文献
[1] 环球网.世卫组织宣告新冠疫情“全球大流行”欧美多国确诊病例激增[EB/OL].（2020-03-13）[2020-03-15].https：//www.sohu.com/a/379661137_162522？_trans_=000014_bdss_dkwhfy. [2] 百度新型冠状病毒肺炎疫情实时大数据报告[EB/OL].（2020-03-15）[2020-03-15].https：//voice.baidu.com/act/newpneumonia/ newpneumonia/？from=osari_pc_3#tab4.
[3] 新浪新闻.国家卫健委印发新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）[EB/OL]. （2020-03-04）[2020-03-15]. http：//news.sina.com.cn/o/2020-03-04/doc-iimxyqvz7707317.shtml.
[4] 许金和，王水良，张胜行，赖国祥，兰小鹏，吴小丽，余宗阳.新型冠状病毒核酸检测方法[J/OL].国际检验医学杂志：1-19[2020-03-16]. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/50.1176.R.20200303.1428.002.html.
[5] 魏徵霄，李青峰.新型冠状病毒感染的临床表现及其实验室检测技术进展～（*）[J/OL].国际检验医学杂志：1-7[2020-03-17]. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/50.1176.r.20200228.1112.002.html.
[6] 安鋼力.实时荧光定量PCR技术的原理及其应用[J].中国现代教育装备，2018（21）：19-21.
[7] 郭晓波，蔺京，来春艳，张养民，龚卫锋，史敏，杨瑞利.新型冠状病毒与实时荧光RT-PCR核酸检测[J].陕西医学杂志，2020，49（03）：264-266.
[8] 高维寅，张洪，罗阳.新型冠状病毒肺炎核酸检测中的假阴性分析及对策～（*）[J/OL].国际检验医学杂志：1-8[2020-03-17]. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/50.1176.R.20200304.1030.004.html.
[9] 新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第六版）[J/OL].天津中医药：1-5[2020-03-17]. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/12.1349.R.20200304.1638.006.html.
3月4日，国家卫健委印发新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）[3]，此诊疗方案中提到，疑似病例的确诊标准之一为实时荧光定量RT-PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，反转录·聚合酶链反应）检测新型冠状病毒核酸阳性。但是，这个被称为“金标准”的实时荧光定量RT-PCR检测技术在临床应用中却被报道存在假阴性，即被检测者已经感染了新型冠状病毒，但是检测不出病毒核酸。
实时荧光定量RT-PCR，很多没有医学、生物背景的朋友初次听到这个名字也许会十分疑惑，什么是核酸？什么是实时荧光定量RT-PCR？为什么被称为“金标准”的RT-PCR检测技术在临床实践过程中并不能100%检测出新型冠状病毒？下面为大家一一解答。
什么是核酸
核酸，简单来讲就是遗传物质，一种能够传递遗传信息的物质，通常由亲代传给子代，能够控制子代的生长发育。一般来说，不同的生物所携带的遗传信息都是独特的（同卵双胞胎除外）。遗传物质分为DNA（脱氧核糖核酸）和RNA（核糖核酸），大多数病毒的遗传物质都为RNA。以新型冠状病毒为例，此病毒的核酸就是RNA，其RNA由四种不同核糖核苷酸排列组成，因为排列的顺序以及所含不同种类核糖核苷酸的数量不同，使得新型冠状病毒的RNA与其他RNA病毒的RNA有所不同。实时荧光定量RT-PCR技术就是利用新型冠状病毒所具有的独特RNA，对其进行特异性检测。
实时荧光定量RT-PCR技术原理
实时荧光定量RT-PCR是将实时荧光定量PCR技术和RT-PCR技术相结合[4]，首先，采用RT-PCR技术，使新型冠状病毒的RNA逆转录DNA;然后，用DNA作为模板，采用实时荧光定量PCR技术对DNA进行扩增[5];同时，使用探针（目前的试剂盒主要使用的是Taq Man探针1）与对应的核酸片段进行结合，结合在核酸片段上的探针在特殊的外切酶活性作用下发生水解，产生荧光。随着DNA片段的不断扩增，荧光信号不断增强，DNA的数量以荧光信号的形式间接地被相关仪器记录。最后，根据荧光信号与扩增循环数之间的关系可以绘制出实时扩增曲线，从而检测出标本中是否含有新型冠状病毒核酸[6-7]。
通俗来讲，新型冠状病毒与实时荧光定量RT-PCR的关系就是，新型冠状病毒的RNA可以看成它的身份证，而实时荧光定量PCR技术中的引物并不能直接识别这种身份证上的信息，所以当我们从患者标本中获取到RNA时，首先需要采用RT-PCR对身份证的信息进行翻译转换，将病毒的RNA逆转录为DNA，使其病毒信息能够被实时荧光定量PCR的引物和探针识别。但是，我们从原始标本获得的RNA太少，低于了仪器检测的下限，所以，我们首先要对获得的信息进行复制扩增，在扩增的同时将这些信息打上标签（探针），而被打上的标签在一定作用下（特定酶水解作用）可以发出荧光，被仪器检测到，这样就可以通过检测病毒核酸的存在来间接证实病毒的存在。
“金标准”为何“失效”
根据上述原理可知，新型冠状病毒的核酸检测与很多因素相关。采用实时荧光定量RT-PCR技术而得到假阴性结果（即已经是感染者，但检测不出病毒核酸）的原因主要有两点[8]。
第一个原因是原始标本中的RNA含量太低，低于了实时荧光定量PCR的检测下限，使得病毒核酸无法得到有效扩增，从而无法产生足够的荧光信号而导致检测结果为阴性。
这与标本的取材、患者感染的时间以及取到标本后检测的时间都有关系。受病毒感染机制影响，不同组织来源的标本病毒核酸含量差异较大。研究显示，新型冠状病毒更趋向于结合肺泡上皮细胞，因此，理论上来说，感染者下呼吸道标本病毒核酸检测准确率会比上呼吸道标本的更高。患者感染的时间也是一个重要因素。病毒在侵入人体细胞之后需要时间去繁殖，如果是早期患者的标本，病毒刚刚入侵细胞，没有足够的时间复制，细胞中也就没有那么多病毒核酸。此外，这次感染的人数众多，人力、物力都十分有限，很多患者标本在取到后都来不及及时检测，在等待检测的时间里，病毒RNA会有一定程度的分解，这也导致了原始病毒的核酸过低。
第二个原因是在原理中提到的探针结合，在实时荧光定量PCR技术中，探针能够特异性结合到病毒核酸片段上，在酶的参与作用下发出荧光信号，从而间接反映病毒核酸的存在。但是，如果探针结合的病毒核酸部位发生变异，可能会影响探针的结合效率，导致荧光信号检测不到，而出现假阴性的结果。
此外，假阴性的发生也跟此技术本身的灵敏度有关，此次新型冠状病毒肺炎暴发得太突然，目前，应用于临床的试剂盒并不成熟，灵敏度还不够。
多方面改善假阴性问题
针对上述假阴性问题，国家正从各方面努力进行改善。比如，标本质量不好，国家卫健委公布的第六版新型冠状病毒肺炎诊疗方案[9]指出需要全面规范采样，在这之后，公开报道的假阴性患者数量明显减少;比如，试剂盒不够灵敏，国内各个医院、研究機构正在不断努力，已经研发出了一些新的核酸检测试剂盒。四川大学华西医院成功研发出了多款新型冠状病毒检测试剂盒，有两项已经进入临床验证阶段。2020年3月，新型冠状病毒引起的肺炎在中国已经初步得到了控制，相信在不久的将来，一切都会恢复正常。
参考文献
[1] 环球网.世卫组织宣告新冠疫情“全球大流行”欧美多国确诊病例激增[EB/OL].（2020-03-13）[2020-03-15].https：//www.sohu.com/a/379661137_162522？_trans_=000014_bdss_dkwhfy. [2] 百度新型冠状病毒肺炎疫情实时大数据报告[EB/OL].（2020-03-15）[2020-03-15].https：//voice.baidu.com/act/newpneumonia/ newpneumonia/？from=osari_pc_3#tab4.
[3] 新浪新闻.国家卫健委印发新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）[EB/OL]. （2020-03-04）[2020-03-15]. http：//news.sina.com.cn/o/2020-03-04/doc-iimxyqvz7707317.shtml.
[4] 许金和，王水良，张胜行，赖国祥，兰小鹏，吴小丽，余宗阳.新型冠状病毒核酸检测方法[J/OL].国际检验医学杂志：1-19[2020-03-16]. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/50.1176.R.20200303.1428.002.html.
[5] 魏徵霄，李青峰.新型冠状病毒感染的临床表现及其实验室检测技术进展～（*）[J/OL].国际检验医学杂志：1-7[2020-03-17]. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/50.1176.r.20200228.1112.002.html.
[6] 安鋼力.实时荧光定量PCR技术的原理及其应用[J].中国现代教育装备，2018（21）：19-21.
[7] 郭晓波，蔺京，来春艳，张养民，龚卫锋，史敏，杨瑞利.新型冠状病毒与实时荧光RT-PCR核酸检测[J].陕西医学杂志，2020，49（03）：264-266.
[8] 高维寅，张洪，罗阳.新型冠状病毒肺炎核酸检测中的假阴性分析及对策～（*）[J/OL].国际检验医学杂志：1-8[2020-03-17]. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/50.1176.R.20200304.1030.004.html.
[9] 新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第六版）[J/OL].天津中医药：1-5[2020-03-17]. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/12.1349.R.20200304.1638.006.html.