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摘要 [目的]设计和构建一种由β-糖苷水解酶Gluc1C和多功能纤维素酶EGX融合而成的纤维素酶嵌合体EGX-Gluc1C。[方法]首先构建了嵌合体的质粒，采用GST标准纯化方法，分别获得重组蛋白Gluc1C、EGX、纤维素酶嵌合体EGX-Gluc1C，并且制备了抗Gluc1C的血清。[结果]通过GST纯化的3个蛋白纯度达90%，可以进行后续的酶活检测；通过Western blot验证，发现抗Gluc1C的血清效价很高（稀释比例达1∶5 000）。[结论]该研究可为纤维素酶的工业化应用提供一定理论依据。
关键词 纤维素酶；EGX；Gluc1C；抗体；纤维素酶嵌合体
中图分类号 S188文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）01-0102-03
Abstract [Objective]To design and construct chimera cellulase EGX-Gluc1C originated from the fusion of β-glucosidase Gluc1C and a cullulase EGX. [Method]First， we generated the plasmid inserting chimera cellulase. Then， we purified the recombinant Gluc1C， EGX and EGX-Gluc1C according to the standard GST purification manual. We also generated the anti-Gluc1C serum from the rabbit. [Result]The coomassie staining results demonstrated that the purity of these proteins was 90%， which was sufficient for enzyme catalytic assay. Through verification of western blot，the anti-Gluc1C serum produced from rabbit was of high quality and the dilution ratio can be 1∶5 000. [Conclusion]The study provided a theoretical basis for the industrial application of cellulase.
Key words Cellulase；EGX；Gluc1C；Antibody；Chimera cellulase
纤维素是陆地环境中最主要的光合作用产物，也是地球上最丰富的可再生生物资源，每年纤维素的产量为1 000亿t左右。纤维素降解无论是在农业生产还是废物处理的过程中，都显得十分重要，因为纖维素处理好就能够得到大量可再生生物资源，处理不好将成为难以降解的生物垃圾[1-3]。纤维素降解需要多种纤维素酶协同作用，如果能够使用一个表达系统同时表达纯化2种甚至多种纤维素酶，则可以降低工业生产中酶的经济投入[4-5]。EGX是从福寿螺中分离得到的一种多功能纤维素酶，Gluc1C是从棉铃虫肠道菌中分离得到的一种高效的β-糖苷水解酶，由448个氨基酸组成，包含糖苷水解酶GH superfamily 1结构域[6]。笔者将EGX和Gluc1C的基因构建在同一个表达质粒上，并表达出有生物活性的纤维素酶嵌合体EGX-Gluc1C，以期为纤维素酶的工业化应用提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与质粒。
试验所用的菌株包括 E.coli TOP10、 E.coli RIL （DE3），质粒pGEX-6p-1、pET22b-Gluc1C和pET32a-EGX。
1.1.2 生化试剂。DNA Taq 酶（康为公司）、KOD Plus Neo聚合酶（TOYOBO）、限制性内切酶（TOYOBO）、T4 DNA连接酶（Thermo Scientific）、胶回收试剂盒（康为公司）、PCR回收试剂盒（康为公司）、Tiangen质粒小提试剂盒、GST resin（Q-Smart公司）。
1.1.3 引物及核苷酸序列。
试验采用的引物用DNAman软件设计，引物合成由武汉天一辉远公司完成，引物名称及序列见表1。
1.2 方法
1.2.1 重组质粒的构建。以实验室已有的pET22b-Gluc1C和pET32a-EGXA作为模板构建EGX-Gluc1C嵌合体。
1.2.2 重组工程菌的制备。
将质粒pGEX-6p-1-EGX-Gluc1C转化大肠杆菌BL 21（DE3）感受态细胞，得到的阳性克隆经PCR鉴定为阳性的菌落即为能表达嵌合体纤维素酶EGX-Gluc1C的大肠杆菌重组基因工程菌RIL pGEX-6p-1-EGX-Gluc1C。
1.2.3 重组蛋白的纯化。按照标准GST树脂结合标签蛋白的方法纯化目的蛋白。蛋白的表达和纯化通过SDS-PAGE以及考马斯亮蓝染色检测。
1.2.4 Gluc1C抗体的制备。
将纯化的纤维素酶嵌合体EGX-Gluc1C包涵体经过SDS-PAGE后，切割包含目的条带的胶条，作为抗原，辅以佐剂Freund’s Adjuvant Incomplete注射进入新西兰大白兔体内，总蛋白量为2 mg，每隔14 d免疫1次，共3次，制备抗Gluc1C的免疫血清。
2 结果与分析
2.1 重组质粒pGEX-6P-1-EGX-Gluc1C的构建 以实验室已有的pET32a-EGXA作为模板，用引物4和5扩增EGX序列，然后再以这一步得到的PCR产物作为模板，用引物4和6扩增包含linker序列的EGX序列。使用酶切位点 Eco R I和 Bam H I将目的序列插入到pGEX-6P-1载体上（图1）。接着以实验室已有的pET22b-Gluc1C作为模板，用引物1和2扩增EGX序列，回收以后，使用酶切位点 Xho I 和 Eco R I將目的序列插入到pGEX-6P-1-EGX（含linker）载体上。图2为嵌合体载体双酶切鉴定结果。接着，将测序正确的3个质粒pGEX-6P-1-EGX、pGEX-6P-1-Gluc1C、pGEX-6P-1-EGX-Gluc1C转入 E.coli RIL（DE3），获得能够表达3个相应蛋白的工程菌。
2.2 融合蛋白的表达与纯化
表达目的蛋白的重组工程菌株RIL pGEX-6P-1-EGX的表达条件为IPTG 0.4 mmol/L，28 ℃诱导表达3 h，培养体积为1 L。根据标准的GST纯化流程进行蛋白纯化。从洗脱组分看，第1次洗脱的蛋白浓度最高，依次减少，获得的蛋白较纯，仅在40 kD上方有一处杂带。通过同样的纯化方法，获得了重组蛋白EGX，EGX-Gluc1C，并且浓缩洗脱组分，最终蛋白浓度统一为0.5 mg/mL（图3）。
2.3 抗Gluc1C抗体的制备及效价检测
为了能够更深入地研究Gluc1C的功能，制备了抗Gluc1C的血清。选择直接用目的蛋白的包涵体作为抗原，经过SDS-PAGE后，切割包含目的条带的胶条，注射进入兔子体内。每隔7 d免疫1次，共3次，最终获得抗Gluc1C的免疫血清，通过Western blot检测了血清的效价。取Gluc1C和嵌合体的诱导前、诱导后蛋白样进行检测发现，获得的免疫血清能够很好地识别目的蛋白Gluc1C，并且也能识别嵌合体（图4）。
3 讨论与结论
纤维素是地球上现存分布最广和含量最丰富的碳水化合物[7]。对人类而言，纤维素也是自然界中数量最大的可再生资源，它的降解和再利用无疑是自然界碳素循环的中心环节。纤维素酶作用于纤维素的分子机制至今没有完全研究清楚，纤维素酶产生菌的产酶能力不足，以及所产生的纤维素酶的组分不全是导致这一领域的研究与实际应用存在一定距离的主要原因[8]。不同的微生物合成的纤维素酶不仅在组成上有显著的差异，而且对纤维素的水解能力也大不相同，原核生物和真核生物均能产纤维素酶[9-10]。该研究构建了纤维素酶嵌合体EGX-Gluc1C ，其中EGX是从福寿螺胃液中分离得到的一种多功能纤维素酶，同时具有多种纤维素酶活性，Gluc1C是从类芽孢杆菌中分离出的一种β-糖苷水解酶。中间以甘氨酸和丝氨酸构成的柔性肽重复序列（G4S）3连接，保证了2个蛋白之间的空间结构不受影响。共获得了纯度较高的3种蛋白，浓缩以后，3种蛋白的浓度统一确定为0.5 mg/mL。同时还获得了效价很高的抗Gluc1C的兔血清，为将来嵌合体的活性研究提供了基础。未来的研究还会涉及到嵌合体在毕赤酵母系统中表达是否会增强其活力；嵌合体在pH耐受、热稳定性方面是否有提高。
参考文献
[1] ADDEN R，NIEDNER W，MULLER R，et al.Comprehensive analysis of the substituent distribution in the glucosyl units and along the polymer chain of hydroxyethylmethyl celluloses and statistical evaluation[J].Anal Chem，2006，78（4）：1146-1157.
[2] PERCIVAL ZHANG Y H，HIMMEL M E，MIELENZ J R.Outlook for cellulase improvement：Screening and selection strategies[J].Biotechnology advances，2006，24（5）： 452-481.
[3] ADSUL M G，SINGHVI M S，GAIKAIWARI S A，et al.Development of biocatalysts for production of commodity chemicals from lignocellulosic biomass[J].Bioresource Technol，2011，102（6）：4304-4312.
[4] BAYER E A，MORAG E，LAMED R.The cellulosome：A treasure-trove for biotechnology[J].Trends Biotechnol，1994，12（9）：379-386.
[5] GHOSE T K.Measurement of cellulase activities[J].Pure Appl Chem，1987， 59：257-268.
[6] ADLAKHA N，SAWANT S，ANIL A，et al.Specific fusion of β-1，4-endoglucanase and β-1，4-glucosidase enhances cellulolytic activity and helps in channeling of intermediates[J].Applied and environmental microbiology，2012，78（20）：7447-7454.
[7] AKCAPINAR G B，GUL O，SEZERMAN U.Effect of codon optimization on the expression of Trichoderma reesei endoglucanase 1 in Pichia pastoris [J].Biotechnol Progr，2011，27（5）：1257-1263.
[8] ALPER H，STEPHANOPOULOS G.Engineering for biofuels：Exploiting innate microbial capacity or importing biosynthetic potential？[J].Nat Rev Microbiol，2009，7（10）：715-723.
[9] ANDERSON T D，ROBSON S A，JIANG X W，et al.Assembly of Minicellulosomes on the surface of Bacillus subtilis [J].Applied and environmental microbiology，2011，77（14）：4849-4858.
[10] ANGENENT L T，KARIM K，AL-DAHHAN M H，et al.Production of bioenergy and biochemicals from industrial and agricultural wastewater[J].Trends Biotechnol，2004，22（9）：477-485.
关键词 纤维素酶；EGX；Gluc1C；抗体；纤维素酶嵌合体
中图分类号 S188文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）01-0102-03
Abstract [Objective]To design and construct chimera cellulase EGX-Gluc1C originated from the fusion of β-glucosidase Gluc1C and a cullulase EGX. [Method]First， we generated the plasmid inserting chimera cellulase. Then， we purified the recombinant Gluc1C， EGX and EGX-Gluc1C according to the standard GST purification manual. We also generated the anti-Gluc1C serum from the rabbit. [Result]The coomassie staining results demonstrated that the purity of these proteins was 90%， which was sufficient for enzyme catalytic assay. Through verification of western blot，the anti-Gluc1C serum produced from rabbit was of high quality and the dilution ratio can be 1∶5 000. [Conclusion]The study provided a theoretical basis for the industrial application of cellulase.
Key words Cellulase；EGX；Gluc1C；Antibody；Chimera cellulase
纤维素是陆地环境中最主要的光合作用产物，也是地球上最丰富的可再生生物资源，每年纤维素的产量为1 000亿t左右。纤维素降解无论是在农业生产还是废物处理的过程中，都显得十分重要，因为纖维素处理好就能够得到大量可再生生物资源，处理不好将成为难以降解的生物垃圾[1-3]。纤维素降解需要多种纤维素酶协同作用，如果能够使用一个表达系统同时表达纯化2种甚至多种纤维素酶，则可以降低工业生产中酶的经济投入[4-5]。EGX是从福寿螺中分离得到的一种多功能纤维素酶，Gluc1C是从棉铃虫肠道菌中分离得到的一种高效的β-糖苷水解酶，由448个氨基酸组成，包含糖苷水解酶GH superfamily 1结构域[6]。笔者将EGX和Gluc1C的基因构建在同一个表达质粒上，并表达出有生物活性的纤维素酶嵌合体EGX-Gluc1C，以期为纤维素酶的工业化应用提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与质粒。
试验所用的菌株包括 E.coli TOP10、 E.coli RIL （DE3），质粒pGEX-6p-1、pET22b-Gluc1C和pET32a-EGX。
1.1.2 生化试剂。DNA Taq 酶（康为公司）、KOD Plus Neo聚合酶（TOYOBO）、限制性内切酶（TOYOBO）、T4 DNA连接酶（Thermo Scientific）、胶回收试剂盒（康为公司）、PCR回收试剂盒（康为公司）、Tiangen质粒小提试剂盒、GST resin（Q-Smart公司）。
1.1.3 引物及核苷酸序列。
试验采用的引物用DNAman软件设计，引物合成由武汉天一辉远公司完成，引物名称及序列见表1。
1.2 方法
1.2.1 重组质粒的构建。以实验室已有的pET22b-Gluc1C和pET32a-EGXA作为模板构建EGX-Gluc1C嵌合体。
1.2.2 重组工程菌的制备。
将质粒pGEX-6p-1-EGX-Gluc1C转化大肠杆菌BL 21（DE3）感受态细胞，得到的阳性克隆经PCR鉴定为阳性的菌落即为能表达嵌合体纤维素酶EGX-Gluc1C的大肠杆菌重组基因工程菌RIL pGEX-6p-1-EGX-Gluc1C。
1.2.3 重组蛋白的纯化。按照标准GST树脂结合标签蛋白的方法纯化目的蛋白。蛋白的表达和纯化通过SDS-PAGE以及考马斯亮蓝染色检测。
1.2.4 Gluc1C抗体的制备。
将纯化的纤维素酶嵌合体EGX-Gluc1C包涵体经过SDS-PAGE后，切割包含目的条带的胶条，作为抗原，辅以佐剂Freund’s Adjuvant Incomplete注射进入新西兰大白兔体内，总蛋白量为2 mg，每隔14 d免疫1次，共3次，制备抗Gluc1C的免疫血清。
2 结果与分析
2.1 重组质粒pGEX-6P-1-EGX-Gluc1C的构建 以实验室已有的pET32a-EGXA作为模板，用引物4和5扩增EGX序列，然后再以这一步得到的PCR产物作为模板，用引物4和6扩增包含linker序列的EGX序列。使用酶切位点 Eco R I和 Bam H I将目的序列插入到pGEX-6P-1载体上（图1）。接着以实验室已有的pET22b-Gluc1C作为模板，用引物1和2扩增EGX序列，回收以后，使用酶切位点 Xho I 和 Eco R I將目的序列插入到pGEX-6P-1-EGX（含linker）载体上。图2为嵌合体载体双酶切鉴定结果。接着，将测序正确的3个质粒pGEX-6P-1-EGX、pGEX-6P-1-Gluc1C、pGEX-6P-1-EGX-Gluc1C转入 E.coli RIL（DE3），获得能够表达3个相应蛋白的工程菌。
2.2 融合蛋白的表达与纯化
表达目的蛋白的重组工程菌株RIL pGEX-6P-1-EGX的表达条件为IPTG 0.4 mmol/L，28 ℃诱导表达3 h，培养体积为1 L。根据标准的GST纯化流程进行蛋白纯化。从洗脱组分看，第1次洗脱的蛋白浓度最高，依次减少，获得的蛋白较纯，仅在40 kD上方有一处杂带。通过同样的纯化方法，获得了重组蛋白EGX，EGX-Gluc1C，并且浓缩洗脱组分，最终蛋白浓度统一为0.5 mg/mL（图3）。
2.3 抗Gluc1C抗体的制备及效价检测
为了能够更深入地研究Gluc1C的功能，制备了抗Gluc1C的血清。选择直接用目的蛋白的包涵体作为抗原，经过SDS-PAGE后，切割包含目的条带的胶条，注射进入兔子体内。每隔7 d免疫1次，共3次，最终获得抗Gluc1C的免疫血清，通过Western blot检测了血清的效价。取Gluc1C和嵌合体的诱导前、诱导后蛋白样进行检测发现，获得的免疫血清能够很好地识别目的蛋白Gluc1C，并且也能识别嵌合体（图4）。
3 讨论与结论
纤维素是地球上现存分布最广和含量最丰富的碳水化合物[7]。对人类而言，纤维素也是自然界中数量最大的可再生资源，它的降解和再利用无疑是自然界碳素循环的中心环节。纤维素酶作用于纤维素的分子机制至今没有完全研究清楚，纤维素酶产生菌的产酶能力不足，以及所产生的纤维素酶的组分不全是导致这一领域的研究与实际应用存在一定距离的主要原因[8]。不同的微生物合成的纤维素酶不仅在组成上有显著的差异，而且对纤维素的水解能力也大不相同，原核生物和真核生物均能产纤维素酶[9-10]。该研究构建了纤维素酶嵌合体EGX-Gluc1C ，其中EGX是从福寿螺胃液中分离得到的一种多功能纤维素酶，同时具有多种纤维素酶活性，Gluc1C是从类芽孢杆菌中分离出的一种β-糖苷水解酶。中间以甘氨酸和丝氨酸构成的柔性肽重复序列（G4S）3连接，保证了2个蛋白之间的空间结构不受影响。共获得了纯度较高的3种蛋白，浓缩以后，3种蛋白的浓度统一确定为0.5 mg/mL。同时还获得了效价很高的抗Gluc1C的兔血清，为将来嵌合体的活性研究提供了基础。未来的研究还会涉及到嵌合体在毕赤酵母系统中表达是否会增强其活力；嵌合体在pH耐受、热稳定性方面是否有提高。
参考文献
[1] ADDEN R，NIEDNER W，MULLER R，et al.Comprehensive analysis of the substituent distribution in the glucosyl units and along the polymer chain of hydroxyethylmethyl celluloses and statistical evaluation[J].Anal Chem，2006，78（4）：1146-1157.
[2] PERCIVAL ZHANG Y H，HIMMEL M E，MIELENZ J R.Outlook for cellulase improvement：Screening and selection strategies[J].Biotechnology advances，2006，24（5）： 452-481.
[3] ADSUL M G，SINGHVI M S，GAIKAIWARI S A，et al.Development of biocatalysts for production of commodity chemicals from lignocellulosic biomass[J].Bioresource Technol，2011，102（6）：4304-4312.
[4] BAYER E A，MORAG E，LAMED R.The cellulosome：A treasure-trove for biotechnology[J].Trends Biotechnol，1994，12（9）：379-386.
[5] GHOSE T K.Measurement of cellulase activities[J].Pure Appl Chem，1987， 59：257-268.
[6] ADLAKHA N，SAWANT S，ANIL A，et al.Specific fusion of β-1，4-endoglucanase and β-1，4-glucosidase enhances cellulolytic activity and helps in channeling of intermediates[J].Applied and environmental microbiology，2012，78（20）：7447-7454.
[7] AKCAPINAR G B，GUL O，SEZERMAN U.Effect of codon optimization on the expression of Trichoderma reesei endoglucanase 1 in Pichia pastoris [J].Biotechnol Progr，2011，27（5）：1257-1263.
[8] ALPER H，STEPHANOPOULOS G.Engineering for biofuels：Exploiting innate microbial capacity or importing biosynthetic potential？[J].Nat Rev Microbiol，2009，7（10）：715-723.
[9] ANDERSON T D，ROBSON S A，JIANG X W，et al.Assembly of Minicellulosomes on the surface of Bacillus subtilis [J].Applied and environmental microbiology，2011，77（14）：4849-4858.
[10] ANGENENT L T，KARIM K，AL-DAHHAN M H，et al.Production of bioenergy and biochemicals from industrial and agricultural wastewater[J].Trends Biotechnol，2004，22（9）：477-485.