【摘 要】
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目的 克隆、表达屋尘螨3类变应原(Der p 3)基因,纯化Der p 3重组蛋白,对其免疫原性及生物信息学特点进行分析.方法 取实验室纯培养的屋尘螨500只,提取总RNA,逆转录生成eDNA,R
【机 构】
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西南医科大学附属医院,泸州,646000;深圳大学过敏反应与免疫学研究所,深圳,518060;西南医科大学附属医院,泸州646000;深圳大学过敏反应与免疫学研究所,深圳518060
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目的 克隆、表达屋尘螨3类变应原(Der p 3)基因,纯化Der p 3重组蛋白,对其免疫原性及生物信息学特点进行分析.方法 取实验室纯培养的屋尘螨500只,提取总RNA,逆转录生成eDNA,RT-PCR扩增Der p 3基因.扩增的Der p 3基因经测序正确后,将目的条带连接至pMD-32T载体中进行扩增,并利用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切,酶切后的片段连接至pET-32a表达载体,转化至大肠埃希菌Rosetta中,经1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,蛋白质印迹(Western boltting)分析重组蛋白的免疫原性.分别采用BLAST、ProtParam、PSIPRED、SWISS-MODEL对重组蛋白的同源性、理化性质、二级结构、三级结构进行分析;通过BLAST和MEGA构建Der p 3的系统进化树;并利用IEBD和DNA Star对Der p 3重组蛋白的抗原表位进行预测.结果 RT-PCR扩增屋尘螨Der p 3基因,得到约1 000 bp的片段,经测序为Derp 3目的序列,其开放阅读框为786 bp,编码261个氨基酸.经IPTG诱导后大量表达Derp3重组蛋白.该蛋白主要以包涵体形式存在,相对分子质量(Mt)约30 000.Western blotting分析结果显示,重组蛋白Derp 3能与10份尘螨过敏性哮喘息者血清IgE抗体特异性结合.BLAST和MEGA分析结果显示,Der p 3基因与粉尘螨3类变应原(Der f 3)的序列一致性较高,约80％.Der p 3蛋白较稳定,二级结构由螺旋、延伸链、随机线圈组成;并预测到6个抗原表位肽序列.结论 纯化后的Derp 3重组蛋白能与尘螨过敏性哮喘患者血清IgE抗体特异性结合,具有较强免疫原性.
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