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【摘 要】叶酸是由喋呤啶、对氨基苯甲酸和谷氨酸等组成的化合物，是一种水溶性B族维生素，相当于蝶酰谷氨酸。固定相为：依利特hypersil BDSC18 色谱柱（4.6*250*5u ），乙腈-甲醇-水-冰醋酸（25：10：65∶0.1）为流动相，检测波长为254nm；叶酸在20～280μg·mL-1范围内呈良好的线性关系。叶酸的平均回收率为99.3%。本法简便、重现性好、回收率高，可用于叶酸片中叶酸的含量测定。
【关键词】叶酸片；叶酸；测定
叶酸是由喋呤啶、对氨基苯甲酸和谷氨酸等组成的化合物，是一种水溶性B族维生素，相当于蝶酰谷氨酸[1-2]。叶酸从菠菜叶中提取纯化的，故而命名为叶酸。叶酸对孕妇尤其重要。叶酸用于预防胎儿神经管畸形，准妈妈在备孕期间就服用0.4毫克叶酸可以下降胎儿神经管畸形率85%[3-4]。如在怀孕头3个月内缺乏叶酸，可导致胎儿神经管发育缺陷，从而增加裂脑儿，无脑儿的发生率。人类如缺乏叶酸可引起巨红细胞性贫血以及白细胞减少症，还会导致身体无力、易怒、没胃口以及精神病症状[5-7]。本文用高效液相法对叶酸片中的叶酸的进行了含量测定。
1.仪器与试药
1.1仪器
LC-100（梯度配置）高效液相色谱仪（上海伍丰科学仪器有限公司） ；CO-1000型色谱柱温箱（武汉恒信世纪科技有限公司）；制冷和加热循环槽（上海汗诺仪器有限公司）；UV-1800紫外/可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；ELGA超纯水器（上海澜锐仪器科技有限公司）；ABS 220-4分析天平（德祥科技有限公司）；3升基本型超声波清洗器（天津市瑞普电子仪器公司）；TΜ-1901 双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。
1.2试药
乙腈（杭州兴成化工有限公司）、磷酸（江西省新干县金成化工厂）、盐酸（襄樊金译成精细化工有限公司）、磷酸氢二铵（淄博市淄川区鑫川化工厂）、冰醋酸（吴江市龙申化工有限公司）、甲醇（江西省新干县金成化工厂）、冰乙酸（杭州兴成化工有限公司）、四氢呋喃（吴江市龙申化工有限公司）。
2.含量测定
2.1色谱条件
依据查阅文献及考查的结果，确定色谱条件如下[8-12]。色谱柱为依利特hypersil BDSC18色谱柱（4.6*250*5u ）；乙腈-甲醇-水-冰醋酸（25：10：65∶0.1）为流动相；检测波长为254nm；流速1.0mL·min-1；柱温：30℃。理论板数按叶酸峰计算应不得低于2000。
2.2供试品溶液的制备
取叶酸片适量，研细，精密称定至容量瓶内，加适量5%氨水超声溶解，放凉，用水定容，过0.45μm的滤膜，即得。
2.3对照品溶液的制备
精密称取叶酸对照品约50mg，置50毫升棕色容量瓶中，用5%氨水超声波振荡溶解并用水稀释至刻度，摇匀，精密吸取10毫升，置100毫升棕色容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得（每1mL溶液中含叶酸100μg）。
2.4阴性干扰试验
按方中比例取叶酸片辅料，按照制备工艺方法制成阴性制剂，按2.3项下方法制成供试品溶液，按色谱条件测定。结果表明：在选定条件下测得的阴性液吸收曲线在与叶酸相同保留时间处不存在吸收峰，说明此方法具有较强的专属性。
2.5标准曲线的制备
制备浓度为20μg·mL-1、40μg·mL-1、80μg·mL-1、160μg·mL-1、200μg·mL-1、240μg·mL-1、280μg·mL-1的对照品溶液，分别精密吸取10μL注入HPLC，记录色谱图。以峰面积积分值A（μg）为横坐标，进样量为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。试验表明，叶酸对照品在40～320μg·mL-1范围内线性关系良好。
2.6精密度试验
精密吸取叶酸对照品溶液10μL重复进样6次，测定峰面积积分值，对照品峰面积积分值的RSD为0.77%。结果表明，本实验精密度良好。
2.7重现性试验
分别称取同批叶酸片样品6份，分别制备成供试品，按色谱条件测定含量，并计算样品的RSD值为0.65%，结果表明，此含量测定方法的重现性良好。
2.8稳定性试验
取供试品溶液，分别在0，1，2，3，4h精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，进样测定，供试品叶酸峰面积积分值的RSD为0.89%。结果表明叶酸至少在4h内稳定。
2.9回收率试验
采用加样回收试验，取已知含量的同一批供试品各6份，精密称定，分精密添加一定量的叶酸对照品，按供试品制备所述方法制备供试品溶液，测定含量（同时测定样品含量），计算回收率。6次测定的平均回收率为99.3%，RSD为0.95%。
2.10样品含量测定
依照上述含量测定方法，测定叶酸片三批样品中叶酸的含量，结果三批样品的含量分别为标示量的99.3%、99.6%、100.1%。
3.讨论
叶酸溶于热的稀盐酸和硫磺，略溶于氢氧化碱和碳酸碱溶液，微溶于甲醇，不溶于乙醇和丁醇。本实验采用5%氨水溶解效果较好。分别考察乙腈-甲醇-水-冰醋酸（25：10：65∶0.1），0.05mol.L-1磷酸二氢钾溶液（用磷酸调pH到3.0）-乙腈（20∶80），乙腈-甲醇-水-冰醋酸（25：20：55∶0.1），乙腈-甲醇-冰乙酸-水（15：15∶3∶67），乙腈-甲醇-四氢呋喃-水（10：15：35∶40），乙腈-甲醇-水（20∶20：60），磷酸二氢钾6.8g与0.1mol·L-1氢氧化钾溶液70mL，加水稀释至800mL，调节pH至6.3，加甲醇200mL，用水稀释成1000mL，磷酸盐缓冲液（0.01mol/L磷酸氢二铵溶液， 用磷酸调节pH 值6.0）-乙腈（60：40）不同比例的流动相，结果以乙腈-甲醇-水-冰醋酸（25：10：65∶0.1）为流动相，供试品各峰分离效果最好，故选用乙腈-甲醇-水-冰醋酸（25：10：65∶0.1）为流动相。本实验方法是一种简便、准确、安全的测定叶酸片含量的方法。叶酸片中叶酸的含量为标示量的95-105%。 [科]
【参考文献】
[1]沈国松，何平亚，张甦，姚娟，卢宝庭，薛建英.早孕妇女红细胞叶酸含量测定及其临床意义[J].浙江医学，2007（08）.
[2]余加林，吴仕孝.新生儿临床标本抗生素敏感性分析[J].医药导报，2001（05）.
[3]程国尊，赵继珍，何晶，李冬，王丽萍，淡以锐.吉林市区75名学龄儿童血清维生素B12、叶酸测定[J].实用儿科临床杂志，1991（05）.
[4]叶酸检测方法及临床应用研究进展[J].中国社区医师（综合版），2006（21）.
[5]方尚玲.葉酸及其检测[J].武汉工业学院学报，2000（01）.
[6]刘筠，方雪娟，朱银星.新生儿缺氧缺血性脑病的观察与护理[J].陕西医学杂志，2001（07）.
[7]杜为君.新生儿缺氧缺血性脑病并发坏死性小肠结肠炎的观察与护理[J].淮海医药，2002（03）.
[8]彭炳先，洪艳平，陈莉莉.液固顶空GC法测定叶酸片中的有机溶剂残留量[J].华西药学杂志，2008（02）.
[9]唐靓，李跃中，陆明旸，王晗，李防赟，王茵.微生物法与HPLC测定药品及食品中叶酸含量的比较及应用[J].中国现代应用药学，2009（12）.
[10]苏玉永，王虎，郑思维.高效液相色谱法测定复方维生素胶囊中维生素B6与叶酸的含量[J].中国医院药学杂志，2005（04）.
[11]夏瑞，车宝泉，张喆，周立春.RP-HPLC测定复方硫酸亚铁叶酸片中叶酸的含量[J].中国药学杂志，2006（23）.
[12]童成亮，吴小英，钟淮滨.HPLC测定马来酸依那普利叶酸片中两种组分的含量[J].中国药学杂志，2006（15）.
【关键词】叶酸片；叶酸；测定
叶酸是由喋呤啶、对氨基苯甲酸和谷氨酸等组成的化合物，是一种水溶性B族维生素，相当于蝶酰谷氨酸[1-2]。叶酸从菠菜叶中提取纯化的，故而命名为叶酸。叶酸对孕妇尤其重要。叶酸用于预防胎儿神经管畸形，准妈妈在备孕期间就服用0.4毫克叶酸可以下降胎儿神经管畸形率85%[3-4]。如在怀孕头3个月内缺乏叶酸，可导致胎儿神经管发育缺陷，从而增加裂脑儿，无脑儿的发生率。人类如缺乏叶酸可引起巨红细胞性贫血以及白细胞减少症，还会导致身体无力、易怒、没胃口以及精神病症状[5-7]。本文用高效液相法对叶酸片中的叶酸的进行了含量测定。
1.仪器与试药
1.1仪器
LC-100（梯度配置）高效液相色谱仪（上海伍丰科学仪器有限公司） ；CO-1000型色谱柱温箱（武汉恒信世纪科技有限公司）；制冷和加热循环槽（上海汗诺仪器有限公司）；UV-1800紫外/可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；ELGA超纯水器（上海澜锐仪器科技有限公司）；ABS 220-4分析天平（德祥科技有限公司）；3升基本型超声波清洗器（天津市瑞普电子仪器公司）；TΜ-1901 双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。
1.2试药
乙腈（杭州兴成化工有限公司）、磷酸（江西省新干县金成化工厂）、盐酸（襄樊金译成精细化工有限公司）、磷酸氢二铵（淄博市淄川区鑫川化工厂）、冰醋酸（吴江市龙申化工有限公司）、甲醇（江西省新干县金成化工厂）、冰乙酸（杭州兴成化工有限公司）、四氢呋喃（吴江市龙申化工有限公司）。
2.含量测定
2.1色谱条件
依据查阅文献及考查的结果，确定色谱条件如下[8-12]。色谱柱为依利特hypersil BDSC18色谱柱（4.6*250*5u ）；乙腈-甲醇-水-冰醋酸（25：10：65∶0.1）为流动相；检测波长为254nm；流速1.0mL·min-1；柱温：30℃。理论板数按叶酸峰计算应不得低于2000。
2.2供试品溶液的制备
取叶酸片适量，研细，精密称定至容量瓶内，加适量5%氨水超声溶解，放凉，用水定容，过0.45μm的滤膜，即得。
2.3对照品溶液的制备
精密称取叶酸对照品约50mg，置50毫升棕色容量瓶中，用5%氨水超声波振荡溶解并用水稀释至刻度，摇匀，精密吸取10毫升，置100毫升棕色容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得（每1mL溶液中含叶酸100μg）。
2.4阴性干扰试验
按方中比例取叶酸片辅料，按照制备工艺方法制成阴性制剂，按2.3项下方法制成供试品溶液，按色谱条件测定。结果表明：在选定条件下测得的阴性液吸收曲线在与叶酸相同保留时间处不存在吸收峰，说明此方法具有较强的专属性。
2.5标准曲线的制备
制备浓度为20μg·mL-1、40μg·mL-1、80μg·mL-1、160μg·mL-1、200μg·mL-1、240μg·mL-1、280μg·mL-1的对照品溶液，分别精密吸取10μL注入HPLC，记录色谱图。以峰面积积分值A（μg）为横坐标，进样量为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。试验表明，叶酸对照品在40～320μg·mL-1范围内线性关系良好。
2.6精密度试验
精密吸取叶酸对照品溶液10μL重复进样6次，测定峰面积积分值，对照品峰面积积分值的RSD为0.77%。结果表明，本实验精密度良好。
2.7重现性试验
分别称取同批叶酸片样品6份，分别制备成供试品，按色谱条件测定含量，并计算样品的RSD值为0.65%，结果表明，此含量测定方法的重现性良好。
2.8稳定性试验
取供试品溶液，分别在0，1，2，3，4h精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，进样测定，供试品叶酸峰面积积分值的RSD为0.89%。结果表明叶酸至少在4h内稳定。
2.9回收率试验
采用加样回收试验，取已知含量的同一批供试品各6份，精密称定，分精密添加一定量的叶酸对照品，按供试品制备所述方法制备供试品溶液，测定含量（同时测定样品含量），计算回收率。6次测定的平均回收率为99.3%，RSD为0.95%。
2.10样品含量测定
依照上述含量测定方法，测定叶酸片三批样品中叶酸的含量，结果三批样品的含量分别为标示量的99.3%、99.6%、100.1%。
3.讨论
叶酸溶于热的稀盐酸和硫磺，略溶于氢氧化碱和碳酸碱溶液，微溶于甲醇，不溶于乙醇和丁醇。本实验采用5%氨水溶解效果较好。分别考察乙腈-甲醇-水-冰醋酸（25：10：65∶0.1），0.05mol.L-1磷酸二氢钾溶液（用磷酸调pH到3.0）-乙腈（20∶80），乙腈-甲醇-水-冰醋酸（25：20：55∶0.1），乙腈-甲醇-冰乙酸-水（15：15∶3∶67），乙腈-甲醇-四氢呋喃-水（10：15：35∶40），乙腈-甲醇-水（20∶20：60），磷酸二氢钾6.8g与0.1mol·L-1氢氧化钾溶液70mL，加水稀释至800mL，调节pH至6.3，加甲醇200mL，用水稀释成1000mL，磷酸盐缓冲液（0.01mol/L磷酸氢二铵溶液， 用磷酸调节pH 值6.0）-乙腈（60：40）不同比例的流动相，结果以乙腈-甲醇-水-冰醋酸（25：10：65∶0.1）为流动相，供试品各峰分离效果最好，故选用乙腈-甲醇-水-冰醋酸（25：10：65∶0.1）为流动相。本实验方法是一种简便、准确、安全的测定叶酸片含量的方法。叶酸片中叶酸的含量为标示量的95-105%。 [科]
【参考文献】
[1]沈国松，何平亚，张甦，姚娟，卢宝庭，薛建英.早孕妇女红细胞叶酸含量测定及其临床意义[J].浙江医学，2007（08）.
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[3]程国尊，赵继珍，何晶，李冬，王丽萍，淡以锐.吉林市区75名学龄儿童血清维生素B12、叶酸测定[J].实用儿科临床杂志，1991（05）.
[4]叶酸检测方法及临床应用研究进展[J].中国社区医师（综合版），2006（21）.
[5]方尚玲.葉酸及其检测[J].武汉工业学院学报，2000（01）.
[6]刘筠，方雪娟，朱银星.新生儿缺氧缺血性脑病的观察与护理[J].陕西医学杂志，2001（07）.
[7]杜为君.新生儿缺氧缺血性脑病并发坏死性小肠结肠炎的观察与护理[J].淮海医药，2002（03）.
[8]彭炳先，洪艳平，陈莉莉.液固顶空GC法测定叶酸片中的有机溶剂残留量[J].华西药学杂志，2008（02）.
[9]唐靓，李跃中，陆明旸，王晗，李防赟，王茵.微生物法与HPLC测定药品及食品中叶酸含量的比较及应用[J].中国现代应用药学，2009（12）.
[10]苏玉永，王虎，郑思维.高效液相色谱法测定复方维生素胶囊中维生素B6与叶酸的含量[J].中国医院药学杂志，2005（04）.
[11]夏瑞，车宝泉，张喆，周立春.RP-HPLC测定复方硫酸亚铁叶酸片中叶酸的含量[J].中国药学杂志，2006（23）.
[12]童成亮，吴小英，钟淮滨.HPLC测定马来酸依那普利叶酸片中两种组分的含量[J].中国药学杂志，2006（15）.