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摘 要：研究20 种中草药水煎液与醇提液对牛肉和羊肉表面总菌的抑制作用。方法：分别用蒸馏水和无水乙醇制备20 种中草药的提取液，然后分别对牛肉和羊肉表面的总菌进行抑菌试验，筛选出抑菌效果好的中草药提取液。结果：丁香、五倍子、石榴皮对牛肉表面总菌有较好的抑制作用，丁香醇提液的抑菌直径20.68mm，最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）值62.5 mg/mL，最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）值125 mg/mL；五倍子水煎液的抑菌直径20.13mm，MIC值125mg/mL，MBC值250 mg/mL；石榴皮醇提液的抑菌直径17.61mm，MIC值250 mg/mL，MBC值500 mg/mL。根据EC50值，抑制作用强弱为丁香醇提液＞五倍子水煎液＞石榴皮醇提液。黄连、五倍子、丁香对羊肉表面总菌有较好的抑制作用，黄连醇提液的抑菌直径20.58mm，MIC值250 mg/mL，MBC值500 mg/mL；五倍子醇提液的抑菌直径18.81mm，丁香醇提液的抑菌直径18.00mm，两者MIC值均为62.50 mg/mL，MBC值均为125 mg/mL。根据EC50值，抑制作用强弱为丁香醇提液＞五倍子醇提液＞黄连醇提液。结论：丁香和五倍子两种中草药对牛肉和羊肉均有较好的抑菌作用，且安全无毒副作用，具有很高的实用价值。
关键词：牛肉；羊肉；表面总菌；中草药；抑制
Inhibitory Effect of 20 Kinds of Chinese Medicinal Herbs on Total Surface Bacteria of Red Meat
CHEN Hui, ZHOU Yan-bing, AI Qi-jun*
(College of Food Science and Engineering, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China)
Abstract: This research aimed to study the inhibitory effect of water and ethanol extracts of 20 kinds of Chinese medicinal herbs (CMH) on total surface bacteria of beef and mutton. Water and anhydrous ethanol were used respectively for the preparation of water and ethanol extracts of CMHs, and their bacteriostatic effects on total surface bacteria of beef and mutton were tested. The CMH species with better bacteriostatic effect were screened from the tested ones. Clove, Chinese gall and pomegranate peel had obvious inhibitory effects on total surface bacteria of beef. The diameter of inhibition zone of the ethanol extract of clove was 20.68 mm, MIC 62.50 mg/mL and MBC 125 mg/mL, compared to 20.13 mm, 125 mg/mL and 250 mg/mL for the water extract of Chinese gall, and 17.61 mm, 250 mg/mL and 500 mg/mL for the ethanol extract of pomegranate peel, respectively. Based upon their EC50, the bacteriostatic activity of the above three extracts on total surface bacteria of beef followed the decreasing order: clove > Chinese gall > pomegranate peel. Coptis root, Chinese gall and clove had obvious inhibitory effects on total surface bacteria of mutton. The diameter of inhibition zone of the ethanol extract of coptis root was 20.58 mm, MIC 250 mg/mL and MBC 500 mg/mL. The diameter of inhibition zone of the ethanol extract of Chinese gall was 18.81 mm, while that of the ethanol extract of clove was 18.00 mm; their MIC and MBC were both 62.50 and 125 mg/mL, respectively. Based upon their EC50, the bacteriostatic activity of these three extracts on total surface bacteria of mutton decreased in the following order: clove > Chinese gallic > coptis root. Taken together, it can be concluded that clove and Chinese gall have better bacteriostatic effect on red meat without having any toxic or adverse effect, thus having high food value.
Key word: beef; mutton; total surface bacteria; Chinese medicinal herb; inhibition
中图分类号：TS251 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2014）01-0022-05
我国是肉类生产消费大国，肉类产量及消费世界第一[1]。牛肉是一种高档食品，深受全世界人民的喜爱，享有“肉中骄子”的美称，具有高蛋白、低脂肪、味道鲜美等特点[2]。羊肉鲜嫩柔软，风味独特，具有营养丰富、容易消化吸收和抗过敏的特点，是集营养和保健于一体的特色肉食品[3]。生鲜肉较易腐败变质，造成肉腐败变质的原因有很多，通常主要有4种因素：物理因素、化学因素、肉品内源酶作用和微生物在肉品表面及内部生长繁殖而引起的破坏作用[4]。在实际生活和生产活动中，这些因素有时是单独起作用，有时是共同起作用。由于微生物几乎无处不在，而肉制品营养丰富，适宜微生物生长繁殖，所以，微生物的污染是导致肉类发生腐败变质的根源[5-6]。细菌特别是霉菌和酵母之类微生物的侵袭, 通常是导致肉食品腐败变质的主要原因[7-8]。因此降低肉初始菌数和抑制残留微生物的生长繁殖成为了延长肉食品保质期的关键问题。
我国是中草药的发源地，目前约有12000种药用植物，各地常用中草药已达5000种左右[9]。中草药因具有广谱、廉价、高效、低毒、无污染、杀菌抑菌和健康环保等优点，日益受到人们的青睐，逐渐成为开发天然保鲜剂的重要来源[10]。中草药中的有效成分能抑制肉表面的微生物活性、降低酶活力、减弱微生物对肉的影响，从而起到抑菌保鲜的作用。因此，应充分探索中草药中的有效抑菌成分及其抑菌效果，为今后研究肉食品天然保鲜剂提供依据。实验采用水煎法和乙醇提取法提取丁香、五倍子、甘草、薄荷、石榴皮、鹿蹄草等20种中草药[11-17]的抑菌溶液，研究不同中草药溶液对牛肉和羊肉表面总菌的抑制效果[18]，以期找到能明显减少牛羊肉表面总菌的中草药溶液。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
甘草根茎（Glycyrrhiza uralensis）、白芷根（Angelica dahurica Benth. et Hook.）、薄荷茎叶（Mentha haplocalyx Briq.）、麦冬根（Ophiopogon japonicus（T.f）Ker-Gawl.）、八角果实（Illicium verum）、丁香花蕾（Syzygiumaromaticum）、肉桂枝皮（Cinnamomum cassia）、白术根茎（Rhizoma Atractylodis macrocephalae）、金银花（Lonicera japonica Thunb.）、鱼腥草全草（Houttuynia cordata）、熟大黄根茎（Rheum palmatum L.）、黄连根茎（Coptidis Rhizoma.）、石榴皮（Punicagranatuml）、连翘果（Forsythia suspensa.）、地榆根（Garden Burnet Root）、艾叶（Folium Artemisiae argyi）、半边莲全草（Lobelia chinensis Lour.）、五倍子果实（Galla chinensis.）、功劳叶（Ilex cornuta Lindl. ex Paxt.）、鹿蹄草全草（Pyrola rotundifolia ssp. chinensis） 北京市回龙观长青大药房。
牛、羊后腿 市购。
营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、无水乙醇北京蓝弋试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
YX-280手提式压力蒸汽灭菌锅 江阴滨江医疗设备厂；SW-CJ-1FD无菌操作台 苏净集团安泰空气技术有限公司；RE-2000B 旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；KQ-500DB型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；DHP-9162型电热恒温培养箱 上海一恒科技有限公司；XMTD-8222型恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；THZ-D型台式恒温振荡器 江苏太仓市实验设备厂。
1.3 方法
1.3.1 供试菌种的活化与保藏
在无菌条件下，用无菌生理盐水分别冲洗新鲜牛、羊后腿肉表面，将冲洗液充分振荡混匀后，分别吸取1 mL接种于无菌营养肉汤培养基中，摇床培养24 h (37 ℃，120r/min)，调节菌种浓度到1×109 CFU/mL，4 ℃冰箱保存备用[19]。
1.3.2 菌悬液制备
无菌操作条件下，分别吸取1 mL带菌营养肉汤培养基，用无菌营养肉汤培养基稀释，制成含菌量105 CFU/mL的菌悬液。
1.3.3 中草药水煎液制备
将中草药粉碎后过40 目筛，称取20 g中草药，加入400 mL蒸馏水，常温浸泡15～20 h，文火煎煮20 min，过滤，药渣加入200 mL蒸馏水，文火煎煮20 min，过滤，合并滤液并在70 ℃进行旋转蒸发，定容至20 mL容量瓶（质量浓度1 g/mL），0～4 ℃冰箱保存备用[20]。
1.3.4 中草药乙醇提取液制备
将中草药粉碎后过40 目筛，称取20 g中草药，加入200 mL质量分数60%乙醇溶液，常温浸泡15～20 h，过滤，在70 ℃进行旋转蒸发，转移到20 mL容量瓶中定容（质量浓度为1 g/mL），0～4 ℃冰箱保存备用[21]。
1.3.5 抑菌直径测定
在无菌条件下，用移液器吸取0.1 mL菌悬液涂布到营养琼脂培养基上，制成含菌平板。采用滤纸片法[22]测定中草药的抑菌效果：用打孔器将定性滤纸打成直径为6 mm的滤纸片，160 ℃干热灭菌15 min，在无菌条件下分别加入质量浓度为1 g/mL的中草药提取液，充分浸泡24 h，再将晾干的带药滤纸片均匀贴于含药平板上，37 ℃恒温培养箱中培养24 h后，测量各种药品的的抑菌圈直径，每种药重复3次，取平均值。以无菌蒸馏水为空白对照（CK1），质量浓度为5×10-4 g/mL乳酸链球菌素溶液为阴性对照（CK2）。
抑菌圈直径/mm=抑菌直径―滤纸片直径（6 mm）
1.3.6 中草药提取液对供试菌最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）[23]
采用二倍稀释法：取10支试管编号为1～10，每支均装有1 mL营养肉汤培养基。向1 号试管加入1 mL中药提取液(药液质量浓度1 g/mL)，混合均匀后吸取1 mL至2 号试管，依次类推至9 号试管，9 号试管吸取1 mL弃去，10 号试管为未加药的空白对照（CK）。每支试管加入0.1 mL过夜培养的供试菌菌悬液，摇床（37 ℃，120r/min）培养24 h，每种处理重复3次。
若培养基透明，未出现浑浊的最低质量浓度即为MIC值；若培养基色泽较深，不易判定结果，则在培养结束后吸取0.1 mL涂布到固体培养基上，培养24 h后观察结果，以无菌生长的最低质量浓度作为该中草药对供试菌的MIC值。
1.3.7 中草药提取液对供试菌最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）的测定[24]
将上述透明的菌药液吸取0.1 mL加入灭菌平板，倒入琼脂培养基混合均匀；不透明的用无菌水冲洗MIC以上质量浓度的平板，将冲洗液接种到固体培养基中，置于37 ℃电热恒温培养箱培养24 h，以培养基表面没有菌落生长的相对应的最小质量浓度，即为该中草药对供试菌的最小杀菌浓度（MBC）。
1.3.8 中草药提取液对供试菌的生长抑制率
参照1.3.3节和1.3.4节配制中草药提取液，制成一定质量浓度的带药培养基，以未加药的培养基为空白对照（CK）。用移液器吸取0.1 mL菌悬液，涂布到营养琼脂培养基上，37 ℃电热恒温培养箱培养24 h，在菌落计数器上数菌落数，每个浓度重复3次，取平均值。
1.3.9 数据处理
应用SPSS数据处理软件以及Excel处理实验数据。求出毒理回归方程、相关系数、有效中浓度（EC50）和标准误差[25]。主要采用公式如下：毒理回归方程Y=a＋bx，相关系数为r；Z=（2Π）-1/2e-1/2（Y-5）；w=Z2/PQ，w是权重系数，P是死亡率，Q=（1—P）；SE（m）=（b-2×
（（Σnw）-1＋（m—`x）-1））1/2（SE（m）是m的标准误，m是lg（EC50），为浓度对数的平均值，n为某浓度的细菌菌落数；SEm（10） =10m（ln（10×SE（m））），SEm（10）为EC50标准误；EC50的95%置信限：10（lg（EC50）±1.96×SE（m））。
2 结果与分析
2.1 中草药提取液的抑菌作用
从表1可看出，五倍子、丁香的水煎液和乙醇提液对牛肉表面总菌均有较好的抑制作用，抑菌直径都比CK2大，在17 mm以上。其中，丁香醇提液的抑菌效果相对最好，抑菌直径20.68 mm；其次为五倍子水煎液，抑菌直径20.13 mm。除丁香和五倍子外，石榴皮对牛肉表面总菌也有较好抑制作用，石榴皮醇提液的抑菌直径17.61 mm。由于丁香中的丁香酚，五倍子中的黄芩苷和石榴皮中的鞣质为主要抑菌成分[26-28]，说明丁香酚、黄芩苷、鞣质对牛肉表面总菌有很好的抑制作用。
表 1 中草药提取液对牛肉表面总菌的抑菌作用（±s，n=3）
Table 1 Mean diameter of inhibition zone of herbal extracts against total surface bacteria of beef (±s, n=3)
药物名称 抑菌直径/mm
水煎液 乙醇提取液
CK1 — —
CK2 5.33±0.02 5.52±0.04
甘草 7.99±0.03 8.03±0.02
大黄 7.97±0.01 8.41±0.01
丁香 18.51±0.01 20.68±0.03
五倍子 20.13±0.02 17.69±0.01
石榴皮 15.77±0.01 17.61±0.03
半边莲 — —
黄连 8.73±0.02 10.30±0.03
连翘 12.35±0.03 9.49±0.01
八角 9.80±0.01 9.51±0.01
金银花 7.77±0.05 —
功劳叶 — 9.66±0.11
麦冬 11.80±0.04 —
白芷 — —
鱼腥草 9.55±0.02 8.23±0.02
白术 — —
薄荷 8.24±0.01 —
地榆 15.68±0.04 16.39±0.05
艾叶 — —
肉桂 9.18±0.01 11.51±0.12
鹿蹄草 9.73±0.02 10.17±0.01
表 2 中草药提取液对羊肉表面总菌的抑菌作用（±s，n=3）
Table 2 Inhibitory effects of herbal extracts against total surface bacteria of mutton (±s, n=3)
药物名称 抑菌直径/mm
水煎液 乙醇提取液
CK1 — —
CK2 5.06±0.01 5.11±0.02
甘草 — —
大黄 8.04±0.05 —
丁香 17.32±0.02 18.60±0.01
五倍子 17.99±0.03 18.81±0.01
石榴皮 16.45±0.12 17.10±0.06
半边莲 — 8.29±0.10
黄连 18.00±0.04 20.58±0.05
连翘 8.63±0.04 —
八角 10.89±0.03 14.02±0.01
金银花 — —
功劳叶 — 7.69±0.03
麦冬 — —
白芷 — —
鱼腥草 7.79±0.03 10.91±0.10
白术 — —
薄荷 — —
地榆 11.23±0.05 15.43±0.02
艾叶 11.79±0.01 10.43±0.03
肉桂 10.34±0.02 11.84±0.01
鹿蹄草 9.47±0.03 7.67±0.05
从表2可看出，黄连、五倍子、丁香的水煎液和乙醇提液对羊肉表面总菌均有较好的抑制作用，抑菌直径都比CK2大，在17 mm以上。其中，黄连乙醇提液的抑菌效果相对最好，抑菌直径20.58 mm；其次为五倍子乙醇提液，抑菌直径18.81 mm；再次为丁香乙醇提液，抑菌直径18.00 mm。由于丁香中的丁香酚，五倍子中的黄芩苷和黄连的小檗碱为主要抑菌成分[26-28]，说明丁香酚、黄芩苷、小檗碱等对羊肉表面总菌有很好的抑制作用。
2.2 MIC和MBC测定
表 3 中草药对牛肉和羊肉表面总菌MIC值的测定结果
Table 3 MIC of herbal extracts against total surface bacteria of
beef and mutton
肉类 中草药提取液 中草药质量浓度/(mg/mL)
500 250 125 62.50 31.25 15.63 7.82 3.91 1.96 对照
牛肉 丁香醇提液 — — — — ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
五倍子水煎液 — — — ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
石榴皮醇提液 — — ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
羊肉 黄连醇提液 — — ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
丁香醇提液 — — — — ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
五倍子醇提液 — — — — ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
注：“＋”表示有菌生长；“—”表示无菌生长。下同。
表3结果表明，丁香醇提液、五倍子水煎液和石榴皮醇提取液对牛肉表面总菌的MIC值依次分别为62.50、125、250mg/mL；黄连醇提液、丁香醇提液和五倍子醇提液对羊肉表面总菌的MIC值为250、62.50、62.50 mg/mL。
表 4 中草药提取液对牛肉和羊肉表面总菌MBC值的测定结果
Table 4 MBC of herbal extracts against total surface bacteria of
beef and mutton
肉类 中草药提取液 中草药质量浓度/(mg/mL)
500 250 125 62.50 31.25 15.63 7.82 3.91 1.96 对照
牛肉 丁香醇提液 — — — ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
五倍子水煎液 — — ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
石榴皮醇提液 — ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
羊肉 黄连醇提液 — ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
丁香醇提液 — — — ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
五倍子醇提液 — — — ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
注：“＋＋”表示有较多菌生长。
表4结果表明，丁香醇提液、五倍子水煎液、石榴皮醇提液对牛肉表面总菌的MBC值为125、250、500 mg/mL，
黄连醇提液、丁香醇提液和五倍子醇提液对羊肉表面总菌的MBC值分别为500、125、125 mg/mL。
2.3 中草药提取液对牛羊肉表面总菌的抑制率和有效中浓度（EC50）的测定
由表5、6可知，不同中草药的药液质量浓度与牛羊肉表面总菌的抑制作用存在相关性，随着质量浓度增高，抑菌率也明显升高。有效中浓度EC50值是衡量药剂毒力的重要指标，EC50值越大，说明药剂的抑菌作用越弱，反之则越强。由表7可知，丁香、五倍子和石榴皮对牛肉表面总菌的EC50值存在很大的差异，分别为137.2891、140.7320 mg/mL
和157.9411 mg/mL；丁香、五倍子和黄连对羊肉表面总菌的EC50值分别为146.3467、165.5961 mg/mL和166.7847 mg/mL。
表 5 中草药提取液对牛肉表面总菌抑制率
Table 5 Inhibition rate of herbal extracts at different concentrations against the total surface bacteria of beef
药物名称 质量浓度/(mg/mL) 抑制率/%
丁香醇提液 1000 97.83a
500 69.51b
250 55.32c
125 47.16d
62.5 37.49e
五倍子水煎液 1000 93.18a
500 68.73b
250 55.29c
125 44.57d
石榴皮醇提液 1000 90.83a
500 66.12b
250 56.82c
CK 0 —
注：同列不同字母表示差异显著（P＜0.05）。下同。
表 6 中草药提取液对羊肉表面总菌的抑制率
Table 6 Inhibition rate of herbal extracts at different concentrations against the total surface bacteria of mutton
药物名称 质量浓度/(mg/mL) 抑制率/%
丁香醇提液 1000 95.39a
500 72.26b
250 58.77c
125 45.41d
62.5 32.44e
五倍子醇提液 1000 88.46a
500 70.62b
250 54.27c
125 45.41d
62.5 30.24e
黄连醇提液 1000 89.35a
500 67.17b
250 56.87c
CK 0 —
表 7 中草药提取液对牛肉和羊肉表面总菌的毒力回归方程及EC50
Table 7 Regression models for the bacteriostatic effects of herbal extracts on total surface bacteria of beef and mutton and their EC50
肉类 药物名称 回归方程 置信区间 相关系数 EC50/(mg/mL) 标准误差
牛肉 丁香醇提液 Y=1.2655＋1.1470x 114.5731～164.5089 0.8979 137.2891 12.6695
五倍子水煎液 Y=2.0534＋1.3715x 112.0027～176.8305 0.9288 140.7320 16.3949
石榴皮醇提液 Y=2.0301＋1.3509x 126.7979～196.7335 0.9564 157.9411 17.6981
羊肉 丁香醇提液 Y=1.4145＋1.6558x 121.4057～176.4114 0.9570 146.3467 13.9508
五倍子醇提液 Y=1.9856＋1.3584x 133.6492～205.1796 0.9839 165.5961 18.1086
黄连醇提液 Y=1.9841＋1.3572x 134.6625～206.5693 0.9737 166.7847 18.2044
根据EC50值定义，中草药对牛肉表面总菌的抑菌作用强弱排列为：丁香醇提液>五倍子水煎液>石榴皮醇提液；对羊肉表面总菌的抑制作用强弱排列为：丁香醇提液＞五倍子醇提液＞黄连醇提液。
3 结 论
结果表明，20种中草药中，有13种中草药对牛肉表面总菌有抑制作用，其中丁香、五倍子、石榴皮3种中草药效果相对较明显。丁香醇提液的抑菌直径为21.68 mm，MIC值62.5 mg/mL，MBC值125 mg/mL；五倍子水煎液的抑菌直径为20.13 mm，MIC值125 mg/mL，MBC值250 mg/mL；石榴皮醇提液的抑菌直径为17.61 mm，MIC值250 mg/mL，MBC值500 mg/mL。根据3种中药的主要抑菌成分推断，丁香酚、黄芩苷、鞣质等对牛肉表面总菌有很好的抑制作用。根据EC50值定义推断出，对牛肉表面总菌的抑制作用最强的为丁香醇提液，其次为五倍子水煎液，最后为石榴皮醇提液。
20种中草药中，有12种中草药对羊肉表面总菌有抑制作用，其中黄连、丁香、五倍子3种中草药效果相对较明显。丁香醇提液的抑菌直径为18.00 mm，MIC值62.50 mg/mL，MBC值125 mg/mL；五倍子醇提液的抑菌直径为18.81 mm，MIC值62.50 mg/mL，MBC值125 mg/mL；黄连醇提液的抑菌直径20.58 mm，MIC值250 mg/mL，MBC值500 mg/mL。根据3种中药的主要抑菌成分推断出，丁香酚、黄芩苷、小檗碱等对羊肉表面总菌有很好的抑制作用。根据EC50值定义推断出羊肉表面总菌的抑制作用最强的为丁香醇提液，其次为五倍子醇提液，最后为黄连醇提液。
本实验为今后进行中草药抑菌保鲜方面的研究和生鲜牛羊肉保鲜方面的研究提供了新的思路和依据。
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关键词：牛肉；羊肉；表面总菌；中草药；抑制
Inhibitory Effect of 20 Kinds of Chinese Medicinal Herbs on Total Surface Bacteria of Red Meat
CHEN Hui, ZHOU Yan-bing, AI Qi-jun*
(College of Food Science and Engineering, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China)
Abstract: This research aimed to study the inhibitory effect of water and ethanol extracts of 20 kinds of Chinese medicinal herbs (CMH) on total surface bacteria of beef and mutton. Water and anhydrous ethanol were used respectively for the preparation of water and ethanol extracts of CMHs, and their bacteriostatic effects on total surface bacteria of beef and mutton were tested. The CMH species with better bacteriostatic effect were screened from the tested ones. Clove, Chinese gall and pomegranate peel had obvious inhibitory effects on total surface bacteria of beef. The diameter of inhibition zone of the ethanol extract of clove was 20.68 mm, MIC 62.50 mg/mL and MBC 125 mg/mL, compared to 20.13 mm, 125 mg/mL and 250 mg/mL for the water extract of Chinese gall, and 17.61 mm, 250 mg/mL and 500 mg/mL for the ethanol extract of pomegranate peel, respectively. Based upon their EC50, the bacteriostatic activity of the above three extracts on total surface bacteria of beef followed the decreasing order: clove > Chinese gall > pomegranate peel. Coptis root, Chinese gall and clove had obvious inhibitory effects on total surface bacteria of mutton. The diameter of inhibition zone of the ethanol extract of coptis root was 20.58 mm, MIC 250 mg/mL and MBC 500 mg/mL. The diameter of inhibition zone of the ethanol extract of Chinese gall was 18.81 mm, while that of the ethanol extract of clove was 18.00 mm; their MIC and MBC were both 62.50 and 125 mg/mL, respectively. Based upon their EC50, the bacteriostatic activity of these three extracts on total surface bacteria of mutton decreased in the following order: clove > Chinese gallic > coptis root. Taken together, it can be concluded that clove and Chinese gall have better bacteriostatic effect on red meat without having any toxic or adverse effect, thus having high food value.
Key word: beef; mutton; total surface bacteria; Chinese medicinal herb; inhibition
中图分类号：TS251 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2014）01-0022-05
我国是肉类生产消费大国，肉类产量及消费世界第一[1]。牛肉是一种高档食品，深受全世界人民的喜爱，享有“肉中骄子”的美称，具有高蛋白、低脂肪、味道鲜美等特点[2]。羊肉鲜嫩柔软，风味独特，具有营养丰富、容易消化吸收和抗过敏的特点，是集营养和保健于一体的特色肉食品[3]。生鲜肉较易腐败变质，造成肉腐败变质的原因有很多，通常主要有4种因素：物理因素、化学因素、肉品内源酶作用和微生物在肉品表面及内部生长繁殖而引起的破坏作用[4]。在实际生活和生产活动中，这些因素有时是单独起作用，有时是共同起作用。由于微生物几乎无处不在，而肉制品营养丰富，适宜微生物生长繁殖，所以，微生物的污染是导致肉类发生腐败变质的根源[5-6]。细菌特别是霉菌和酵母之类微生物的侵袭, 通常是导致肉食品腐败变质的主要原因[7-8]。因此降低肉初始菌数和抑制残留微生物的生长繁殖成为了延长肉食品保质期的关键问题。
我国是中草药的发源地，目前约有12000种药用植物，各地常用中草药已达5000种左右[9]。中草药因具有广谱、廉价、高效、低毒、无污染、杀菌抑菌和健康环保等优点，日益受到人们的青睐，逐渐成为开发天然保鲜剂的重要来源[10]。中草药中的有效成分能抑制肉表面的微生物活性、降低酶活力、减弱微生物对肉的影响，从而起到抑菌保鲜的作用。因此，应充分探索中草药中的有效抑菌成分及其抑菌效果，为今后研究肉食品天然保鲜剂提供依据。实验采用水煎法和乙醇提取法提取丁香、五倍子、甘草、薄荷、石榴皮、鹿蹄草等20种中草药[11-17]的抑菌溶液，研究不同中草药溶液对牛肉和羊肉表面总菌的抑制效果[18]，以期找到能明显减少牛羊肉表面总菌的中草药溶液。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
甘草根茎（Glycyrrhiza uralensis）、白芷根（Angelica dahurica Benth. et Hook.）、薄荷茎叶（Mentha haplocalyx Briq.）、麦冬根（Ophiopogon japonicus（T.f）Ker-Gawl.）、八角果实（Illicium verum）、丁香花蕾（Syzygiumaromaticum）、肉桂枝皮（Cinnamomum cassia）、白术根茎（Rhizoma Atractylodis macrocephalae）、金银花（Lonicera japonica Thunb.）、鱼腥草全草（Houttuynia cordata）、熟大黄根茎（Rheum palmatum L.）、黄连根茎（Coptidis Rhizoma.）、石榴皮（Punicagranatuml）、连翘果（Forsythia suspensa.）、地榆根（Garden Burnet Root）、艾叶（Folium Artemisiae argyi）、半边莲全草（Lobelia chinensis Lour.）、五倍子果实（Galla chinensis.）、功劳叶（Ilex cornuta Lindl. ex Paxt.）、鹿蹄草全草（Pyrola rotundifolia ssp. chinensis） 北京市回龙观长青大药房。
牛、羊后腿 市购。
营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、无水乙醇北京蓝弋试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
YX-280手提式压力蒸汽灭菌锅 江阴滨江医疗设备厂；SW-CJ-1FD无菌操作台 苏净集团安泰空气技术有限公司；RE-2000B 旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；KQ-500DB型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；DHP-9162型电热恒温培养箱 上海一恒科技有限公司；XMTD-8222型恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；THZ-D型台式恒温振荡器 江苏太仓市实验设备厂。
1.3 方法
1.3.1 供试菌种的活化与保藏
在无菌条件下，用无菌生理盐水分别冲洗新鲜牛、羊后腿肉表面，将冲洗液充分振荡混匀后，分别吸取1 mL接种于无菌营养肉汤培养基中，摇床培养24 h (37 ℃，120r/min)，调节菌种浓度到1×109 CFU/mL，4 ℃冰箱保存备用[19]。
1.3.2 菌悬液制备
无菌操作条件下，分别吸取1 mL带菌营养肉汤培养基，用无菌营养肉汤培养基稀释，制成含菌量105 CFU/mL的菌悬液。
1.3.3 中草药水煎液制备
将中草药粉碎后过40 目筛，称取20 g中草药，加入400 mL蒸馏水，常温浸泡15～20 h，文火煎煮20 min，过滤，药渣加入200 mL蒸馏水，文火煎煮20 min，过滤，合并滤液并在70 ℃进行旋转蒸发，定容至20 mL容量瓶（质量浓度1 g/mL），0～4 ℃冰箱保存备用[20]。
1.3.4 中草药乙醇提取液制备
将中草药粉碎后过40 目筛，称取20 g中草药，加入200 mL质量分数60%乙醇溶液，常温浸泡15～20 h，过滤，在70 ℃进行旋转蒸发，转移到20 mL容量瓶中定容（质量浓度为1 g/mL），0～4 ℃冰箱保存备用[21]。
1.3.5 抑菌直径测定
在无菌条件下，用移液器吸取0.1 mL菌悬液涂布到营养琼脂培养基上，制成含菌平板。采用滤纸片法[22]测定中草药的抑菌效果：用打孔器将定性滤纸打成直径为6 mm的滤纸片，160 ℃干热灭菌15 min，在无菌条件下分别加入质量浓度为1 g/mL的中草药提取液，充分浸泡24 h，再将晾干的带药滤纸片均匀贴于含药平板上，37 ℃恒温培养箱中培养24 h后，测量各种药品的的抑菌圈直径，每种药重复3次，取平均值。以无菌蒸馏水为空白对照（CK1），质量浓度为5×10-4 g/mL乳酸链球菌素溶液为阴性对照（CK2）。
抑菌圈直径/mm=抑菌直径―滤纸片直径（6 mm）
1.3.6 中草药提取液对供试菌最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）[23]
采用二倍稀释法：取10支试管编号为1～10，每支均装有1 mL营养肉汤培养基。向1 号试管加入1 mL中药提取液(药液质量浓度1 g/mL)，混合均匀后吸取1 mL至2 号试管，依次类推至9 号试管，9 号试管吸取1 mL弃去，10 号试管为未加药的空白对照（CK）。每支试管加入0.1 mL过夜培养的供试菌菌悬液，摇床（37 ℃，120r/min）培养24 h，每种处理重复3次。
若培养基透明，未出现浑浊的最低质量浓度即为MIC值；若培养基色泽较深，不易判定结果，则在培养结束后吸取0.1 mL涂布到固体培养基上，培养24 h后观察结果，以无菌生长的最低质量浓度作为该中草药对供试菌的MIC值。
1.3.7 中草药提取液对供试菌最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）的测定[24]
将上述透明的菌药液吸取0.1 mL加入灭菌平板，倒入琼脂培养基混合均匀；不透明的用无菌水冲洗MIC以上质量浓度的平板，将冲洗液接种到固体培养基中，置于37 ℃电热恒温培养箱培养24 h，以培养基表面没有菌落生长的相对应的最小质量浓度，即为该中草药对供试菌的最小杀菌浓度（MBC）。
1.3.8 中草药提取液对供试菌的生长抑制率
参照1.3.3节和1.3.4节配制中草药提取液，制成一定质量浓度的带药培养基，以未加药的培养基为空白对照（CK）。用移液器吸取0.1 mL菌悬液，涂布到营养琼脂培养基上，37 ℃电热恒温培养箱培养24 h，在菌落计数器上数菌落数，每个浓度重复3次，取平均值。
1.3.9 数据处理
应用SPSS数据处理软件以及Excel处理实验数据。求出毒理回归方程、相关系数、有效中浓度（EC50）和标准误差[25]。主要采用公式如下：毒理回归方程Y=a＋bx，相关系数为r；Z=（2Π）-1/2e-1/2（Y-5）；w=Z2/PQ，w是权重系数，P是死亡率，Q=（1—P）；SE（m）=（b-2×
（（Σnw）-1＋（m—`x）-1））1/2（SE（m）是m的标准误，m是lg（EC50），为浓度对数的平均值，n为某浓度的细菌菌落数；SEm（10） =10m（ln（10×SE（m））），SEm（10）为EC50标准误；EC50的95%置信限：10（lg（EC50）±1.96×SE（m））。
2 结果与分析
2.1 中草药提取液的抑菌作用
从表1可看出，五倍子、丁香的水煎液和乙醇提液对牛肉表面总菌均有较好的抑制作用，抑菌直径都比CK2大，在17 mm以上。其中，丁香醇提液的抑菌效果相对最好，抑菌直径20.68 mm；其次为五倍子水煎液，抑菌直径20.13 mm。除丁香和五倍子外，石榴皮对牛肉表面总菌也有较好抑制作用，石榴皮醇提液的抑菌直径17.61 mm。由于丁香中的丁香酚，五倍子中的黄芩苷和石榴皮中的鞣质为主要抑菌成分[26-28]，说明丁香酚、黄芩苷、鞣质对牛肉表面总菌有很好的抑制作用。
表 1 中草药提取液对牛肉表面总菌的抑菌作用（±s，n=3）
Table 1 Mean diameter of inhibition zone of herbal extracts against total surface bacteria of beef (±s, n=3)
药物名称 抑菌直径/mm
水煎液 乙醇提取液
CK1 — —
CK2 5.33±0.02 5.52±0.04
甘草 7.99±0.03 8.03±0.02
大黄 7.97±0.01 8.41±0.01
丁香 18.51±0.01 20.68±0.03
五倍子 20.13±0.02 17.69±0.01
石榴皮 15.77±0.01 17.61±0.03
半边莲 — —
黄连 8.73±0.02 10.30±0.03
连翘 12.35±0.03 9.49±0.01
八角 9.80±0.01 9.51±0.01
金银花 7.77±0.05 —
功劳叶 — 9.66±0.11
麦冬 11.80±0.04 —
白芷 — —
鱼腥草 9.55±0.02 8.23±0.02
白术 — —
薄荷 8.24±0.01 —
地榆 15.68±0.04 16.39±0.05
艾叶 — —
肉桂 9.18±0.01 11.51±0.12
鹿蹄草 9.73±0.02 10.17±0.01
表 2 中草药提取液对羊肉表面总菌的抑菌作用（±s，n=3）
Table 2 Inhibitory effects of herbal extracts against total surface bacteria of mutton (±s, n=3)
药物名称 抑菌直径/mm
水煎液 乙醇提取液
CK1 — —
CK2 5.06±0.01 5.11±0.02
甘草 — —
大黄 8.04±0.05 —
丁香 17.32±0.02 18.60±0.01
五倍子 17.99±0.03 18.81±0.01
石榴皮 16.45±0.12 17.10±0.06
半边莲 — 8.29±0.10
黄连 18.00±0.04 20.58±0.05
连翘 8.63±0.04 —
八角 10.89±0.03 14.02±0.01
金银花 — —
功劳叶 — 7.69±0.03
麦冬 — —
白芷 — —
鱼腥草 7.79±0.03 10.91±0.10
白术 — —
薄荷 — —
地榆 11.23±0.05 15.43±0.02
艾叶 11.79±0.01 10.43±0.03
肉桂 10.34±0.02 11.84±0.01
鹿蹄草 9.47±0.03 7.67±0.05
从表2可看出，黄连、五倍子、丁香的水煎液和乙醇提液对羊肉表面总菌均有较好的抑制作用，抑菌直径都比CK2大，在17 mm以上。其中，黄连乙醇提液的抑菌效果相对最好，抑菌直径20.58 mm；其次为五倍子乙醇提液，抑菌直径18.81 mm；再次为丁香乙醇提液，抑菌直径18.00 mm。由于丁香中的丁香酚，五倍子中的黄芩苷和黄连的小檗碱为主要抑菌成分[26-28]，说明丁香酚、黄芩苷、小檗碱等对羊肉表面总菌有很好的抑制作用。
2.2 MIC和MBC测定
表 3 中草药对牛肉和羊肉表面总菌MIC值的测定结果
Table 3 MIC of herbal extracts against total surface bacteria of
beef and mutton
肉类 中草药提取液 中草药质量浓度/(mg/mL)
500 250 125 62.50 31.25 15.63 7.82 3.91 1.96 对照
牛肉 丁香醇提液 — — — — ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
五倍子水煎液 — — — ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
石榴皮醇提液 — — ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
羊肉 黄连醇提液 — — ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
丁香醇提液 — — — — ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
五倍子醇提液 — — — — ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
注：“＋”表示有菌生长；“—”表示无菌生长。下同。
表3结果表明，丁香醇提液、五倍子水煎液和石榴皮醇提取液对牛肉表面总菌的MIC值依次分别为62.50、125、250mg/mL；黄连醇提液、丁香醇提液和五倍子醇提液对羊肉表面总菌的MIC值为250、62.50、62.50 mg/mL。
表 4 中草药提取液对牛肉和羊肉表面总菌MBC值的测定结果
Table 4 MBC of herbal extracts against total surface bacteria of
beef and mutton
肉类 中草药提取液 中草药质量浓度/(mg/mL)
500 250 125 62.50 31.25 15.63 7.82 3.91 1.96 对照
牛肉 丁香醇提液 — — — ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
五倍子水煎液 — — ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
石榴皮醇提液 — ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
羊肉 黄连醇提液 — ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
丁香醇提液 — — — ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
五倍子醇提液 — — — ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
注：“＋＋”表示有较多菌生长。
表4结果表明，丁香醇提液、五倍子水煎液、石榴皮醇提液对牛肉表面总菌的MBC值为125、250、500 mg/mL，
黄连醇提液、丁香醇提液和五倍子醇提液对羊肉表面总菌的MBC值分别为500、125、125 mg/mL。
2.3 中草药提取液对牛羊肉表面总菌的抑制率和有效中浓度（EC50）的测定
由表5、6可知，不同中草药的药液质量浓度与牛羊肉表面总菌的抑制作用存在相关性，随着质量浓度增高，抑菌率也明显升高。有效中浓度EC50值是衡量药剂毒力的重要指标，EC50值越大，说明药剂的抑菌作用越弱，反之则越强。由表7可知，丁香、五倍子和石榴皮对牛肉表面总菌的EC50值存在很大的差异，分别为137.2891、140.7320 mg/mL
和157.9411 mg/mL；丁香、五倍子和黄连对羊肉表面总菌的EC50值分别为146.3467、165.5961 mg/mL和166.7847 mg/mL。
表 5 中草药提取液对牛肉表面总菌抑制率
Table 5 Inhibition rate of herbal extracts at different concentrations against the total surface bacteria of beef
药物名称 质量浓度/(mg/mL) 抑制率/%
丁香醇提液 1000 97.83a
500 69.51b
250 55.32c
125 47.16d
62.5 37.49e
五倍子水煎液 1000 93.18a
500 68.73b
250 55.29c
125 44.57d
石榴皮醇提液 1000 90.83a
500 66.12b
250 56.82c
CK 0 —
注：同列不同字母表示差异显著（P＜0.05）。下同。
表 6 中草药提取液对羊肉表面总菌的抑制率
Table 6 Inhibition rate of herbal extracts at different concentrations against the total surface bacteria of mutton
药物名称 质量浓度/(mg/mL) 抑制率/%
丁香醇提液 1000 95.39a
500 72.26b
250 58.77c
125 45.41d
62.5 32.44e
五倍子醇提液 1000 88.46a
500 70.62b
250 54.27c
125 45.41d
62.5 30.24e
黄连醇提液 1000 89.35a
500 67.17b
250 56.87c
CK 0 —
表 7 中草药提取液对牛肉和羊肉表面总菌的毒力回归方程及EC50
Table 7 Regression models for the bacteriostatic effects of herbal extracts on total surface bacteria of beef and mutton and their EC50
肉类 药物名称 回归方程 置信区间 相关系数 EC50/(mg/mL) 标准误差
牛肉 丁香醇提液 Y=1.2655＋1.1470x 114.5731～164.5089 0.8979 137.2891 12.6695
五倍子水煎液 Y=2.0534＋1.3715x 112.0027～176.8305 0.9288 140.7320 16.3949
石榴皮醇提液 Y=2.0301＋1.3509x 126.7979～196.7335 0.9564 157.9411 17.6981
羊肉 丁香醇提液 Y=1.4145＋1.6558x 121.4057～176.4114 0.9570 146.3467 13.9508
五倍子醇提液 Y=1.9856＋1.3584x 133.6492～205.1796 0.9839 165.5961 18.1086
黄连醇提液 Y=1.9841＋1.3572x 134.6625～206.5693 0.9737 166.7847 18.2044
根据EC50值定义，中草药对牛肉表面总菌的抑菌作用强弱排列为：丁香醇提液>五倍子水煎液>石榴皮醇提液；对羊肉表面总菌的抑制作用强弱排列为：丁香醇提液＞五倍子醇提液＞黄连醇提液。
3 结 论
结果表明，20种中草药中，有13种中草药对牛肉表面总菌有抑制作用，其中丁香、五倍子、石榴皮3种中草药效果相对较明显。丁香醇提液的抑菌直径为21.68 mm，MIC值62.5 mg/mL，MBC值125 mg/mL；五倍子水煎液的抑菌直径为20.13 mm，MIC值125 mg/mL，MBC值250 mg/mL；石榴皮醇提液的抑菌直径为17.61 mm，MIC值250 mg/mL，MBC值500 mg/mL。根据3种中药的主要抑菌成分推断，丁香酚、黄芩苷、鞣质等对牛肉表面总菌有很好的抑制作用。根据EC50值定义推断出，对牛肉表面总菌的抑制作用最强的为丁香醇提液，其次为五倍子水煎液，最后为石榴皮醇提液。
20种中草药中，有12种中草药对羊肉表面总菌有抑制作用，其中黄连、丁香、五倍子3种中草药效果相对较明显。丁香醇提液的抑菌直径为18.00 mm，MIC值62.50 mg/mL，MBC值125 mg/mL；五倍子醇提液的抑菌直径为18.81 mm，MIC值62.50 mg/mL，MBC值125 mg/mL；黄连醇提液的抑菌直径20.58 mm，MIC值250 mg/mL，MBC值500 mg/mL。根据3种中药的主要抑菌成分推断出，丁香酚、黄芩苷、小檗碱等对羊肉表面总菌有很好的抑制作用。根据EC50值定义推断出羊肉表面总菌的抑制作用最强的为丁香醇提液，其次为五倍子醇提液，最后为黄连醇提液。
本实验为今后进行中草药抑菌保鲜方面的研究和生鲜牛羊肉保鲜方面的研究提供了新的思路和依据。
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