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摘要:耐辐射奇球菌中的IrrE基因能增强转IrrE基因油菜的盐胁迫耐受性。为了进一步筛选植物体内与IrrE相互作用蛋白,从而加深对盐胁迫耐受性分子调控网络的认识,根据IrrE基因的开放阅读框设计引物,从PBI121-IrrE上扩增该基因的编码区,将其克隆到酵母表达载体pGBKT7中,获得IrrE的酵母表达载体pGBKT7-IrrE,测序结果表明:pGBKT7-IrrE载体构建成功,可用于后续的酵母双杂交文库的筛选工作。
关键词:IrrE基因;酵母;载体构建
中图分类号: S565.4 文献标识码:A 文章编号:1674-0432(2010)-10-0039-2
0 前言
耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans,DR)是在极端环境条件下生长的细菌,是Anderson等在1956 年从灭菌处理的肉类中发现的一种非病原性红色球菌,该球菌对电离辐射(存活最高剂量约15kGy,即普通真核生物的1000 倍) 、紫外线、干燥、强氧化剂和一些化学诱变剂显示惊人的抗性。IrrE又名pprI,是耐辐射球菌中发现的一个极其重要的DNA损伤修复的开关基因,它可调节DR细菌中recA 和ppr A基因的表达,而这两个基因编码的重组酶A和辐射诱导蛋白,可能修复电离辐射引起的DNA损伤。IrrE能提高E.coli在氧化、高温、酸性pH、高渗透压胁迫,特别是高盐胁迫下的耐受性;同时在转IrrE油菜中,该基因能引起胁迫应答基因CBF1/CBF3,SOS2,SOS1,SOD上调表达,使转基因植株能耐受高达350mmol/LNaCl的胁迫。在我们的研究中,盐胁迫转基因油菜与野生型油菜相比POD、SOD和CAT三种抗氧化酶的活性都增加,MAD含量比野生型低,同时脯氨酸和可溶性蛋白含量均比野生型油菜的含量高。
酵母双杂交系统是由Fields和Song等人建立的,用于研究真核细胞中蛋白-蛋白相互作用的一种有效方法。本研究将IrrE克隆到酵母表达载体pGBKT7中,获得IrrE的酵母双杂交诱饵表达载体pGBKT7-IrrE,为进一步利用酵母双杂交系统筛选拟南芥中与IrrE相互作用的蛋白奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
质粒载体pGBKT7由四川大学遗传实验室惠赠;E.coli JM109菌株由本试验室保存;PrimeSTAR HS DNA Polymerase Taq、DNA聚合酶、限制性内切酶、T4 DNA Ligase 等均购自TaKaRa公司;质粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒及其他生物学试剂等购自成都博瑞克生物技术公司。
1.2 方法
1.2.1 引物的设计与合成 根据NCBI上已公布的IrrE序列设计引物,Prime F:5’CCGGAATTCATGTGCCCAGTGCCAACGTCAG3’;PrimeR: 5’CGCGGATCCTACGGCCCGTCCAGTTCACTGTG3’,其中上游引物加EcoR1酶切位点,下游引物加BamH1酶切位点(由上海英俊合成)。
1.2.2 目的基因的扩增 以连接在PBI121上IrrE基因为模板,用PrimeSTAR HS DNA Polymerase Taq 酶扩增IrrE基因。PCR反应按以下体系进行:ddH2Oμl,dNTP4 μl,上下游引物各2μl,模板1μl,PrimeSTAR HS DNA Polymerase Taq酶0.5μl,10×PCR緩冲液5μl;PCR 反应条件为:94℃预变性3 min;94 ℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸90s,32个循环;72℃后延伸10min。
1.2.3 pGBKT7-IrrE的构建 将上述PCR扩增得到的IrrE基因进行胶回收后,用EcoR1和BamH1酶切扩增得到的片段,同时用相同酶酶切载体 pGBKT7,回收目的片段并测定含量,将酶切后的IrrE基因与pGBKT7载体按照摩尔比3:1混合,于16℃过夜连接,转化大肠杆菌JM109感受态细胞。在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上进行筛选阳性克隆。挑取阳性菌落进行培养,提取质粒,采用双酶切和PCR扩增法进行鉴定,PCR鉴定出的阳性克隆再次送上海华大基因有限公司进行测序。
2 结果与分析
2.1 IrrE基因的PCR扩增
利用所设计的引物扩增出IrrE的编码区,经1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,结果显示扩增片段为1004bp,与预期结果相符合,且无非特异扩增现象(如图1)。
图1 IrrE基因的PCR扩增
注:M为Marker,1为阳性对照,2为阴性对照,3-7为转化的大肠杆菌
2.2 pGBKT7-IrrE载体的鉴定
以T7和IrrE down primer为引物,随机挑取5个阳性菌落对其进行PCR扩增检测,均扩增出一条1000bp左右的条带(如图2),与预期结果相符。提取一个阳性克隆的pGBKT7-IrrE质粒,采用EcoR1和BamH1进行双酶切,酶切释放片段大小正确(如图3),表明IrrE已经连接到pGBKT7载体上。序列比对分析显示的扩增片段与NCBI数据库中的相应记录完全一致,表明酵母表达载体pGBKT7-IrrE构建成功。
图2 IrrE基因在大肠杆菌中的PCR检测图
注:M为Marker,1为阳性对照,2为阴性对照,3-7为转化的大肠杆菌
图3 pGBKT7-IrrE质粒的双酶切图
注:M为Marker,1为pGBKT7-IrrE质粒,2双酶切后的质粒
3 讨论
酵母双杂交系统是在研究真核基因转录调控中建立的。其基本原理基于对很多真核生物调控转录起始过程的认识,其起始位点特异转录激活因子通常具有两个彼此可分割开的结构域,即DNA 特异结合域(DNA–binding domain,BD)与转录激活结构域(Transcriptional activation domain,AD)。这两个结构域功能各不相同,互不影响,但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。基于这个原理,可将两个待测蛋白分别与这两个结构域构建成融合蛋白,并共表达于同一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用,就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。本研究以PBI121载体上的IrrE为模板扩增出IrrE基因,并将其克隆在酵母表达载体中,构建了酵母表达载体pGBKT7-IrrE,为利用酵母双杂交筛选与IrrE相互作用的蛋白奠定了基础。
参考文献
[1] Anderson A W,Nordan H C,Cain R F,et al.Studies on a radio2resistant micrococcus.i.isolation, morphology, cultural characteristics, and resistance to gamma radiation. Food Technol ,1956,10:575-578.
[2] Battista J R,Earl A M,Park M J.Why is Deinococcus radiodurans so resistant to ionizing radiation.Trends Microbiol,1999,7:362-365.
作者简介:杜世章(1965-),男,绵阳师范学院副教授,研究方向:分子生物学。
关键词:IrrE基因;酵母;载体构建
中图分类号: S565.4 文献标识码:A 文章编号:1674-0432(2010)-10-0039-2
0 前言
耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans,DR)是在极端环境条件下生长的细菌,是Anderson等在1956 年从灭菌处理的肉类中发现的一种非病原性红色球菌,该球菌对电离辐射(存活最高剂量约15kGy,即普通真核生物的1000 倍) 、紫外线、干燥、强氧化剂和一些化学诱变剂显示惊人的抗性。IrrE又名pprI,是耐辐射球菌中发现的一个极其重要的DNA损伤修复的开关基因,它可调节DR细菌中recA 和ppr A基因的表达,而这两个基因编码的重组酶A和辐射诱导蛋白,可能修复电离辐射引起的DNA损伤。IrrE能提高E.coli在氧化、高温、酸性pH、高渗透压胁迫,特别是高盐胁迫下的耐受性;同时在转IrrE油菜中,该基因能引起胁迫应答基因CBF1/CBF3,SOS2,SOS1,SOD上调表达,使转基因植株能耐受高达350mmol/LNaCl的胁迫。在我们的研究中,盐胁迫转基因油菜与野生型油菜相比POD、SOD和CAT三种抗氧化酶的活性都增加,MAD含量比野生型低,同时脯氨酸和可溶性蛋白含量均比野生型油菜的含量高。
酵母双杂交系统是由Fields和Song等人建立的,用于研究真核细胞中蛋白-蛋白相互作用的一种有效方法。本研究将IrrE克隆到酵母表达载体pGBKT7中,获得IrrE的酵母双杂交诱饵表达载体pGBKT7-IrrE,为进一步利用酵母双杂交系统筛选拟南芥中与IrrE相互作用的蛋白奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
质粒载体pGBKT7由四川大学遗传实验室惠赠;E.coli JM109菌株由本试验室保存;PrimeSTAR HS DNA Polymerase Taq、DNA聚合酶、限制性内切酶、T4 DNA Ligase 等均购自TaKaRa公司;质粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒及其他生物学试剂等购自成都博瑞克生物技术公司。
1.2 方法
1.2.1 引物的设计与合成 根据NCBI上已公布的IrrE序列设计引物,Prime F:5’CCGGAATTCATGTGCCCAGTGCCAACGTCAG3’;PrimeR: 5’CGCGGATCCTACGGCCCGTCCAGTTCACTGTG3’,其中上游引物加EcoR1酶切位点,下游引物加BamH1酶切位点(由上海英俊合成)。
1.2.2 目的基因的扩增 以连接在PBI121上IrrE基因为模板,用PrimeSTAR HS DNA Polymerase Taq 酶扩增IrrE基因。PCR反应按以下体系进行:ddH2Oμl,dNTP4 μl,上下游引物各2μl,模板1μl,PrimeSTAR HS DNA Polymerase Taq酶0.5μl,10×PCR緩冲液5μl;PCR 反应条件为:94℃预变性3 min;94 ℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸90s,32个循环;72℃后延伸10min。
1.2.3 pGBKT7-IrrE的构建 将上述PCR扩增得到的IrrE基因进行胶回收后,用EcoR1和BamH1酶切扩增得到的片段,同时用相同酶酶切载体 pGBKT7,回收目的片段并测定含量,将酶切后的IrrE基因与pGBKT7载体按照摩尔比3:1混合,于16℃过夜连接,转化大肠杆菌JM109感受态细胞。在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上进行筛选阳性克隆。挑取阳性菌落进行培养,提取质粒,采用双酶切和PCR扩增法进行鉴定,PCR鉴定出的阳性克隆再次送上海华大基因有限公司进行测序。
2 结果与分析
2.1 IrrE基因的PCR扩增
利用所设计的引物扩增出IrrE的编码区,经1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,结果显示扩增片段为1004bp,与预期结果相符合,且无非特异扩增现象(如图1)。
图1 IrrE基因的PCR扩增
注:M为Marker,1为阳性对照,2为阴性对照,3-7为转化的大肠杆菌
2.2 pGBKT7-IrrE载体的鉴定
以T7和IrrE down primer为引物,随机挑取5个阳性菌落对其进行PCR扩增检测,均扩增出一条1000bp左右的条带(如图2),与预期结果相符。提取一个阳性克隆的pGBKT7-IrrE质粒,采用EcoR1和BamH1进行双酶切,酶切释放片段大小正确(如图3),表明IrrE已经连接到pGBKT7载体上。序列比对分析显示的扩增片段与NCBI数据库中的相应记录完全一致,表明酵母表达载体pGBKT7-IrrE构建成功。
图2 IrrE基因在大肠杆菌中的PCR检测图
注:M为Marker,1为阳性对照,2为阴性对照,3-7为转化的大肠杆菌
图3 pGBKT7-IrrE质粒的双酶切图
注:M为Marker,1为pGBKT7-IrrE质粒,2双酶切后的质粒
3 讨论
酵母双杂交系统是在研究真核基因转录调控中建立的。其基本原理基于对很多真核生物调控转录起始过程的认识,其起始位点特异转录激活因子通常具有两个彼此可分割开的结构域,即DNA 特异结合域(DNA–binding domain,BD)与转录激活结构域(Transcriptional activation domain,AD)。这两个结构域功能各不相同,互不影响,但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。基于这个原理,可将两个待测蛋白分别与这两个结构域构建成融合蛋白,并共表达于同一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用,就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。本研究以PBI121载体上的IrrE为模板扩增出IrrE基因,并将其克隆在酵母表达载体中,构建了酵母表达载体pGBKT7-IrrE,为利用酵母双杂交筛选与IrrE相互作用的蛋白奠定了基础。
参考文献
[1] Anderson A W,Nordan H C,Cain R F,et al.Studies on a radio2resistant micrococcus.i.isolation, morphology, cultural characteristics, and resistance to gamma radiation. Food Technol ,1956,10:575-578.
[2] Battista J R,Earl A M,Park M J.Why is Deinococcus radiodurans so resistant to ionizing radiation.Trends Microbiol,1999,7:362-365.
作者简介:杜世章(1965-),男,绵阳师范学院副教授,研究方向:分子生物学。