【摘 要】
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根据已知猪圆环病毒2型(PCV2)序列设计引物,PCR扩增出579 bp去除信号肽的ORF2基因片段,将其克隆人表达载体pGEX-4T-1的BamH I和Xho I位点构建重组质粒,转化Rossetta(DM3)进行
【机 构】
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山东省滨州畜牧兽医研究院,山东绿都安特动物药业有限公司
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根据已知猪圆环病毒2型(PCV2)序列设计引物,PCR扩增出579 bp去除信号肽的ORF2基因片段,将其克隆人表达载体pGEX-4T-1的BamH I和Xho I位点构建重组质粒,转化Rossetta(DM3)进行诱导表达,经检测表达蛋白以包涵体形式存在.用GST蛋白纯化试剂盒纯化目的蛋白,SDS-PAGE检测只存在一条约45.3 ku的目的条带,纯度达到90%以上.Western blot分析表明纯化的目的蛋白具有良好的免疫反应性.以纯化的蛋白为抗原,建立了间接ELISA诊断方法及组装了试剂盒,确定了最适的抗原包被浓度为0.625 μg/mL,抗体稀释浓度为1∶100,确定临界值为0.371.该试剂盒与猪圆环病毒1型(PCV1)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)血清无交叉反应性;与北京世纪元亨公司ELISA试剂盒相比其特异性、敏感性、符合率分别为90%、93.3%、91%;对同份血清样品批内、批间重复性试验变异系数均小于10%;稳定性试验变异系数小于5%,在4 ℃条件下保存期可达12个月;对240份临床血清检出率为80%.结果表明,研制的ELISA诊断试剂盒具有良好的特异性、敏感性,重复性、稳定性,完全达到国内外同类产品质量要求,可大规模应用于临床检测.
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