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摘要：建立稀碱法提取僵蚕蛋白质的最佳工艺，并对其进行相应SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）指纹图谱分析。单因素考察缓冲液pH值、液料比、提取时间和提取温度对僵蚕碱溶性蛋白质提取率的影响，随后以Box-Behnken組合设计响应面优化，对试验结果进行回归拟合分析，获得上述因素对碱溶性蛋白质提取率的量化关系，确定最佳提取条件，并对提取的碱溶性蛋白质进行SDS-PAGE指纹图谱分析。结果表明最佳提取工艺条件为：Tris-HCl（三羟甲基氨基甲烷盐酸盐）缓冲液pH值8.0、液料比58 mL ∶ 1 g，提取温度为40 ℃，提取时间为 205 min，此时碱溶性蛋白质提取率可达2.29%。SDS-PAGE指纹图谱结果表明僵蚕碱溶性蛋白质含有29.85、27.28 ku 2条迁移率相近的高丰度特征性条带，分别占总蛋白量的36.37%、32.65%，同时还有78.8、69 ku较高丰度特征性条带，该指纹图谱具有种属特异性。本研究建立了僵蚕碱溶性蛋白质的最佳提取工艺条件，所得SDS-PAGE指纹图谱可为僵蚕药材的分子鉴定提供参考依据。
关键词：僵蚕;碱溶性蛋白质;响应面;提取工艺;指纹图谱
僵蚕（Bombyx Batryticatus）为蚕蛾科昆虫家蚕（Bombyx mori L.）4～5龄的幼虫感染（或人工接种）白僵菌[Beauveria bassiana （Bals.） Vuillant]而致死的干燥体，为我国常用的大宗动物类中药材[1]。因其息风止痉、祛风止痛、化痰散结的功效，僵蚕常用于抽动障碍、支气管哮喘、顽固性蛋白尿及多种儿科疾病的临床治疗，且疗效甚佳[2-3]。由于僵蚕售价较高，市场常见增质量僵蚕、绿僵蚕、黄僵蚕、鼓炒僵蚕等伪品出售，严重影响临床用药的安全性与有效性[4]。
当前僵蚕主要由药工依其身直、肥壮、质坚、色白、断面光亮程度鉴别真伪及划分等级。此外，赵建国等用红外光谱法鉴别僵蚕[5]，张丽增等用薄层法鉴别僵蚕及含有僵蚕的中成药[6]，贾静等建立了僵蚕药材的DNA条形码，为建立相应分子鉴定技术提供了参考[7]。僵蚕含有丰富的蛋白质，但未有系统提取工艺及特征种属蛋白质研究的报道。本研究旨在建立僵蚕蛋白质的稀碱法提取工艺，并以Design-Expert软件进行响应面优化，进而建立僵蚕碱溶性蛋白质的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）指纹图谱，为后续研究基于蛋白质组成的僵蚕分子鉴定技术提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
僵蚕于2019年购自安徽亳州中药材市场（批号9-23539），经江苏大学药学院欧阳臻教授鉴定为蚕蛾科昆虫家蚕4～5龄的幼虫感染（或人工接种）白僵菌而致死的干燥体。
牛血清白蛋白（BSA）、Bradford蛋白浓度测定试剂盒[生工生物工程（上海）股份有限公司];蛋白质分子量标准品（上海碧云天生物技术有限公司）;丙烯酰胺、N，N′-亚甲双丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠、考马斯亮蓝R-250（中国医药集团有限公司）。
1.2 仪器与设备
CS-700高速智能粉碎机（武义海纳电器有限公司）、SpectraMax 190酶标仪（美国Molecular devices公司）、H1650-W台式微量高速离心机（湘仪离心机仪器有限公司）、FE20型实验室pH计（Mettler Toledo 公司）、垂直电泳槽VE-180（上海天能科技有限公司）、DYY-6C稳流稳压电泳仪（南京驰顺科技发展有限公司）、GenoSens 2100凝胶成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司）。
1.3 试验方法
1.3.1 蛋白质提取 僵蚕药材水洗后40 ℃烘干，打粉后过70目筛，称取适量僵蚕粉末，按预设液料比加入0.1 mol/L Tris-HCl（三羟甲基氨基甲烷盐酸盐）缓冲液，50 ℃水浴振荡，到预设提取时间后以9 700 g离心10 min，上清即为碱溶性蛋白质样品。
1.3.2 蛋白质提取率测定 以考马斯亮蓝（Bradford）法测定蛋白质含量，牛血清白蛋白溶液作为蛋白质工作液，测定溶液的D595 nm[8-9]。以蛋白质浓度为横坐标x，吸光度为纵坐标y，绘制标准曲线，得到回归方程y=2.925 7x 0.191 3（r2=0999 3）。对“1.3.1”节所述蛋白质样品进行相应的处理，测定D595 nm值，依据标准曲线可得蛋白质含量，按式（1）计算蛋白质提取率。
蛋白质提取率=提取液中的蛋白质质量僵蚕粉末质量×100%。（1）
1.3.3 单因素试验 （1）pH值对僵蚕蛋白质提取率的影响试验。固定提取温度50 ℃，提取时间 200 min，液料比40 mL ∶ 1 g，Tris-HCl缓冲液pH值分别设置为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。（2）液料比对僵蚕蛋白质提取率的影响试验。固定Tris-HCl缓冲液pH值8.0，提取温度50 ℃，提取时间 200 min，液料比分别设置为10 mL ∶ 1 g、25 mL ∶ 1 g、40 mL ∶ 1 g、55 mL ∶ 1 g、70 mL ∶ 1 g。温度对僵蚕蛋白质提取率的影响试验：固定提取时间200 min，Tris-HCl缓冲液pH 值为8.0，液料比为55 mL ∶ 1 g，提取温度分别设置为30、40、50、60、70 ℃。（3）时间对僵蚕蛋白质提取率的影响试验。固定提取温度40 ℃，Tris-HCl缓冲液pH值为 80，液料比为 55 mL ∶ 1 g，提取时间分别为100、150、200、250、300 min。
1.3.4 响应面试验 采用Design-Expert（8.0.6.1）软件，根据Box-Behnexn设计响应面试验，以Tris-HCl缓冲液pH、液料比、提取温度、提取时间4个因素为自变量，僵蚕碱溶性蛋白质提取率为响应值，设计4因素3水平响应面分析试验，其因素与编码水平见表1。 1.3.5 SDS-PAGE分析 利用最佳条件下提取得到的僵蚕提取液，向其中加入体积分数为10%的三氯乙酸（TCA），涡旋，14 000 r/min离心10 min，弃溶液。加入适量丙酮后，再次涡旋，离心，得到僵蚕碱溶蛋白质。加裂解液，置于4 ℃冰箱中待其充分溶解，加上样缓冲液，沸水浴煮沸10 min，即得到蛋白质电泳样品。制备5%浓缩胶和14%分离胶，80 V 恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂距离凝胶底部05 cm处，停止电泳，剥凝胶，进行固定、染色、脱色[10]。
1.3.6 凝胶分析 使用凝胶成像仪对凝胶拍照，用Quantity One软件计算僵蚕碱溶性蛋白质的分子量和灰度值，按式（2）计算各蛋白质的含量。
蛋白质含量=待测蛋白质灰度值蛋白质总灰度值×100%。（2）
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果分析
蛋白质为兼性分子，缓冲液pH值可以显著影响其溶解度。考察pH值为 7.0～9.0时僵蚕碱溶性蛋白质的提取率变化，结果见图2-A。在pH值为7.0～8.0之间，碱溶性蛋白质的提取率随着pH值的升高而增加，当pH值达到8.0时提取率为最高，随后提取率随pH值升高而逐步降低。因此，缓冲液pH值为 8.0为最适条件。
缓冲液体积越大，越有利于蛋白质的溶出，但过高的液料比会导致后处理较为困难。考察液料比为（10～70） mL ∶ 1 g时僵蚕碱溶性蛋白质提取率变化，结果见图2-B。在一定范围内，随着提取液体积的增大，僵蚕碱溶性蛋白质的提取率呈上升趋势，液料比为55 mL ∶ 1 g时提取率达到最大值。进一步提高液料比，蛋白质提取率反而呈下降趋势，因此，液料比55 mL ∶ 1 g为最适条件。
提取温度升高可以加速蛋白质溶出，且增加其溶出量。考察提取温度为30～70 ℃时僵蚕碱溶性蛋白质提取率变化，结果如图2-C所示。在30～40 ℃的范围内，蛋白质提取率逐渐增加，40 ℃时达到最大值。进一步升高提取温度则导致蛋白质提取率逐步降低，可能由温度升高导致僵蚕蛋白质变性所致，因而最适提取温度为40 ℃。
提取时间延长可以增加蛋白质溶出量。考察提取时间为100～300 min时僵蚕碱溶性蛋白质提取率变化，结果见图2-D。提取时间在100～200 min 內时，提取率呈直线式上升趋势;提取时间超过200 min后，提取率却随着提取时间的延长而缓慢下降。因此最佳提取时间为200 min。
2.2 响应面分析及优化条件
根据单因素试验结果，设计响应面优化试验（表1），综合考察缓冲液pH值、液料比、提取温度和提取时间对蛋白质提取率的影响，试验结果见表2，僵蚕蛋白质提取率在1.495%～2.275%。
对二次回归方程进行方差分析，结果见表3。从表3可知，回归模型具有极显著性（P
关键词：僵蚕;碱溶性蛋白质;响应面;提取工艺;指纹图谱
僵蚕（Bombyx Batryticatus）为蚕蛾科昆虫家蚕（Bombyx mori L.）4～5龄的幼虫感染（或人工接种）白僵菌[Beauveria bassiana （Bals.） Vuillant]而致死的干燥体，为我国常用的大宗动物类中药材[1]。因其息风止痉、祛风止痛、化痰散结的功效，僵蚕常用于抽动障碍、支气管哮喘、顽固性蛋白尿及多种儿科疾病的临床治疗，且疗效甚佳[2-3]。由于僵蚕售价较高，市场常见增质量僵蚕、绿僵蚕、黄僵蚕、鼓炒僵蚕等伪品出售，严重影响临床用药的安全性与有效性[4]。
当前僵蚕主要由药工依其身直、肥壮、质坚、色白、断面光亮程度鉴别真伪及划分等级。此外，赵建国等用红外光谱法鉴别僵蚕[5]，张丽增等用薄层法鉴别僵蚕及含有僵蚕的中成药[6]，贾静等建立了僵蚕药材的DNA条形码，为建立相应分子鉴定技术提供了参考[7]。僵蚕含有丰富的蛋白质，但未有系统提取工艺及特征种属蛋白质研究的报道。本研究旨在建立僵蚕蛋白质的稀碱法提取工艺，并以Design-Expert软件进行响应面优化，进而建立僵蚕碱溶性蛋白质的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）指纹图谱，为后续研究基于蛋白质组成的僵蚕分子鉴定技术提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
僵蚕于2019年购自安徽亳州中药材市场（批号9-23539），经江苏大学药学院欧阳臻教授鉴定为蚕蛾科昆虫家蚕4～5龄的幼虫感染（或人工接种）白僵菌而致死的干燥体。
牛血清白蛋白（BSA）、Bradford蛋白浓度测定试剂盒[生工生物工程（上海）股份有限公司];蛋白质分子量标准品（上海碧云天生物技术有限公司）;丙烯酰胺、N，N′-亚甲双丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠、考马斯亮蓝R-250（中国医药集团有限公司）。
1.2 仪器与设备
CS-700高速智能粉碎机（武义海纳电器有限公司）、SpectraMax 190酶标仪（美国Molecular devices公司）、H1650-W台式微量高速离心机（湘仪离心机仪器有限公司）、FE20型实验室pH计（Mettler Toledo 公司）、垂直电泳槽VE-180（上海天能科技有限公司）、DYY-6C稳流稳压电泳仪（南京驰顺科技发展有限公司）、GenoSens 2100凝胶成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司）。
1.3 试验方法
1.3.1 蛋白质提取 僵蚕药材水洗后40 ℃烘干，打粉后过70目筛，称取适量僵蚕粉末，按预设液料比加入0.1 mol/L Tris-HCl（三羟甲基氨基甲烷盐酸盐）缓冲液，50 ℃水浴振荡，到预设提取时间后以9 700 g离心10 min，上清即为碱溶性蛋白质样品。
1.3.2 蛋白质提取率测定 以考马斯亮蓝（Bradford）法测定蛋白质含量，牛血清白蛋白溶液作为蛋白质工作液，测定溶液的D595 nm[8-9]。以蛋白质浓度为横坐标x，吸光度为纵坐标y，绘制标准曲线，得到回归方程y=2.925 7x 0.191 3（r2=0999 3）。对“1.3.1”节所述蛋白质样品进行相应的处理，测定D595 nm值，依据标准曲线可得蛋白质含量，按式（1）计算蛋白质提取率。
蛋白质提取率=提取液中的蛋白质质量僵蚕粉末质量×100%。（1）
1.3.3 单因素试验 （1）pH值对僵蚕蛋白质提取率的影响试验。固定提取温度50 ℃，提取时间 200 min，液料比40 mL ∶ 1 g，Tris-HCl缓冲液pH值分别设置为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。（2）液料比对僵蚕蛋白质提取率的影响试验。固定Tris-HCl缓冲液pH值8.0，提取温度50 ℃，提取时间 200 min，液料比分别设置为10 mL ∶ 1 g、25 mL ∶ 1 g、40 mL ∶ 1 g、55 mL ∶ 1 g、70 mL ∶ 1 g。温度对僵蚕蛋白质提取率的影响试验：固定提取时间200 min，Tris-HCl缓冲液pH 值为8.0，液料比为55 mL ∶ 1 g，提取温度分别设置为30、40、50、60、70 ℃。（3）时间对僵蚕蛋白质提取率的影响试验。固定提取温度40 ℃，Tris-HCl缓冲液pH值为 80，液料比为 55 mL ∶ 1 g，提取时间分别为100、150、200、250、300 min。
1.3.4 响应面试验 采用Design-Expert（8.0.6.1）软件，根据Box-Behnexn设计响应面试验，以Tris-HCl缓冲液pH、液料比、提取温度、提取时间4个因素为自变量，僵蚕碱溶性蛋白质提取率为响应值，设计4因素3水平响应面分析试验，其因素与编码水平见表1。 1.3.5 SDS-PAGE分析 利用最佳条件下提取得到的僵蚕提取液，向其中加入体积分数为10%的三氯乙酸（TCA），涡旋，14 000 r/min离心10 min，弃溶液。加入适量丙酮后，再次涡旋，离心，得到僵蚕碱溶蛋白质。加裂解液，置于4 ℃冰箱中待其充分溶解，加上样缓冲液，沸水浴煮沸10 min，即得到蛋白质电泳样品。制备5%浓缩胶和14%分离胶，80 V 恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂距离凝胶底部05 cm处，停止电泳，剥凝胶，进行固定、染色、脱色[10]。
1.3.6 凝胶分析 使用凝胶成像仪对凝胶拍照，用Quantity One软件计算僵蚕碱溶性蛋白质的分子量和灰度值，按式（2）计算各蛋白质的含量。
蛋白质含量=待测蛋白质灰度值蛋白质总灰度值×100%。（2）
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果分析
蛋白质为兼性分子，缓冲液pH值可以显著影响其溶解度。考察pH值为 7.0～9.0时僵蚕碱溶性蛋白质的提取率变化，结果见图2-A。在pH值为7.0～8.0之间，碱溶性蛋白质的提取率随着pH值的升高而增加，当pH值达到8.0时提取率为最高，随后提取率随pH值升高而逐步降低。因此，缓冲液pH值为 8.0为最适条件。
缓冲液体积越大，越有利于蛋白质的溶出，但过高的液料比会导致后处理较为困难。考察液料比为（10～70） mL ∶ 1 g时僵蚕碱溶性蛋白质提取率变化，结果见图2-B。在一定范围内，随着提取液体积的增大，僵蚕碱溶性蛋白质的提取率呈上升趋势，液料比为55 mL ∶ 1 g时提取率达到最大值。进一步提高液料比，蛋白质提取率反而呈下降趋势，因此，液料比55 mL ∶ 1 g为最适条件。
提取温度升高可以加速蛋白质溶出，且增加其溶出量。考察提取温度为30～70 ℃时僵蚕碱溶性蛋白质提取率变化，结果如图2-C所示。在30～40 ℃的范围内，蛋白质提取率逐渐增加，40 ℃时达到最大值。进一步升高提取温度则导致蛋白质提取率逐步降低，可能由温度升高导致僵蚕蛋白质变性所致，因而最适提取温度为40 ℃。
提取时间延长可以增加蛋白质溶出量。考察提取时间为100～300 min时僵蚕碱溶性蛋白质提取率变化，结果见图2-D。提取时间在100～200 min 內时，提取率呈直线式上升趋势;提取时间超过200 min后，提取率却随着提取时间的延长而缓慢下降。因此最佳提取时间为200 min。
2.2 响应面分析及优化条件
根据单因素试验结果，设计响应面优化试验（表1），综合考察缓冲液pH值、液料比、提取温度和提取时间对蛋白质提取率的影响，试验结果见表2，僵蚕蛋白质提取率在1.495%～2.275%。
对二次回归方程进行方差分析，结果见表3。从表3可知，回归模型具有极显著性（P