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[摘要]目的：探讨黑布药膏对兔耳增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响。方法：成年大耳白兔24只，建立兔耳腹侧面增生性瘢痕模型，21天后,将瘢痕动物模型随机分为黑布药膏治疗组和瘢痕模型组，在黑布药膏治疗组瘢痕局部涂抹黑布药膏，每3天一次。在用药后第2、4、6、8周分别切取两组瘢痕组织，对比研究在瘢痕形成过程中黑布药膏对兔耳瘢痕成纤维细胞的影响。采用HE染色法观察瘢痕形态，计算瘢痕增生指数和成纤维细胞密度；采用免疫组化方法检测增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白表达。结果：黑布药膏治疗组和模型对照组比较，PCNA蛋白表达明显减弱(P<0.05)，光镜下见黑布药膏能明显抑制成纤维细胞增殖；黑布药膏能降低瘢痕增生指数和成纤维细胞密度，与模型对照组比较，差异有显著性意义(P<0.05)。结论：黑布药膏可抑制兔耳增生性瘢痕成纤维细胞增殖。
[关键词]黑布药膏；兔耳增生性瘢痕；成纤维细胞；细胞增殖
[中图分类号]R619+.6[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2011）07-1103-03
Effectiveness of Heibu ointment on the hypertrophic scarring in the rabbit ears by histomorpology
ZHAO Li,LIU Bo,ZHOU Xiao-hong
(Liaoning College of Health Vocational Technology,Shenyang 110101,Liaoning,China)
Abstract:0bjectiveTo investigate the effect of Heibu ointment on proliferative activity offibroblasts in the hypetrrophic scarring models in rabbitears．MethodsTwenty-four white rabbits were used to establish the models of hypertrophic scar in ears．After twenty-one days, the modles were randomly divided into Heibuointment treatment group and modle group，Heibuointment was plastered on the hypetrrophic scarring ofHeibuointment treatmentgroup once every three days. The material was respectively taken on the second, the fourth, the sixth and the eighth week, to study the changes of fibroblasts with Heibu ointment and compare with the controls during the process of forming hypertrophic scars. Observe the scars morphology by HE staining technique, calculate the scar elevation index and density of fibroblasts；The expression of proliferation cell nuclear antigen (PCNA) protein was measured by immunohistochemistry technique.ResultsTheexpressionofPCNA ofHeibuointment treatmentgroup was viously weaker than the controls(P<0.05). Heibuointment couldreduce the scar elevation index and density of fibroblasts (P<0.05).ConculusionHeibuointment couldinhibitthe proliferationof fibroblasts inhypertrophicscarsof rabbitears.
Key words:Heibu ointment;hypertrophic scarring of rabbit ear;fibroblast；cell proliferation
增生性瘢痕(Hypertrophicscar，HS)是病理性瘢痕的一种，是皮肤真皮损伤愈合后遗留的高出周围正常皮肤、发红、坚硬的病理结构，可以出现瘙痒、疼痛等不适症状。临床用黑布药膏治疗增生性瘢痕疗效确切，但其作用机理一直未见报道，本实验用黑布药膏治疗兔耳增生性瘢痕，通过与对照组比较瘢痕增生指数、成纤维细胞密度和增殖细胞核抗原蛋白表达，来研究黑布药膏对兔耳增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响，探讨其对增生性瘢痕的作用机制。
1材料
1.1动物与药物：同参考文献[1]。
1.3 试剂与器材：明胶、苏木素-伊红染液、50%硝酸溶液、1%甲酸溶液、OLYMPUS光学显微镜、LKB超薄切片机、计算机图像分析系统均由中国医科大学组胚教研室提供。鼠抗兔PCNA单克隆抗体（批号为BM0104），SABC试剂盒（批号为SA1020），DAB显色试剂盒（批号为AR1020），均购于武汉博士德生物工程有限公司。
2方法
2.1分组与造模：分组、造模方法、给药方法及取材方法同参考文献[1]，各组组织均4%多聚甲醛固定48h后常规脱水，石蜡包埋，连续切片，厚度为3～5μm。
2.2观察指标
2.2.1瘢痕增生指数（Scar elevation index，SEI）：HE染色切片，低倍镜下用纤维测量尺测量，计算瘢痕增生指数。按公式SEI=A/B计算瘢痕增生指数。A=瘢痕凸起最高点至耳软骨表面的垂直高度；B=瘢痕周边正常皮肤皮缘至耳软骨表面的垂直高度。
2.2.2成纤维细胞密度(density of fibroblasts，NA)：HE染色切片，400倍光镜下观察, 在瘢痕中央浅部、中央深部、两侧部各随机选取10个矩形视野，目测计数并计算单位面积内成纤维细胞的数量，结果取均数。
2.2.3 PCNA蛋白测定：应用常规2步免疫组化法，按试剂盒说明书操作。以PBS代替一抗作为阴性对照，细胞核内含有棕黄色颗粒者为阳性细胞。在400倍光镜下观察结果，每张切片找5个阳性细胞最多的视野进行计数，阳性细胞反应率=阳性细胞数/细胞总数×100%，结果取均数。
2.3统计学处理：数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较用t检验，采用 SPSS13.0进行数据处理，P＜0.05为差异有显著意义。
3结果
3.1 瘢痕增生指数的比较：黑布药膏可降低瘢痕增生指数，从上皮化第4周开始治疗组与模型组有显著性差异（P＜0.01），并随着时间推移，瘢痕增生指数降低愈加明显，见表1。
3.2 成纤维细胞密度的比较：模型组成纤维细胞密度明显高于正常组，与正常组比较有显著性差异（P＜0.01），在上皮化后4周达到最高值，之后逐渐降低。黑布药膏可降低成纤维细胞密度，与模型组比较有显著性差异（P＜0.05），见表2。
3.3 PCNA检测结果：正常皮肤表皮基底细胞层PCNA阳性表达，真皮层阳性表达较少。模型组除基底细胞PCNA阳性表达及部分棘细胞层和颗粒细胞层呈阳性表达外，真皮层见大量PCNA阳性表达细胞，在上皮化后4周达到最高值，与正常组比较有显著性差异(P＜0.01)。黑布药膏治疗组PCNA阳性细胞较模型组明显减少，相比有显著性差异(P＜0.01)，见表2。
4讨论
4.1 HS是皮肤创伤后组织过度修复的结果，其特征为大量结缔组织基质、尤其是胶原的过度合成与沉积，而成纤维细胞是产生胶原等细胞外基质的功能性细胞，成纤维细胞的过度增殖导致大量成纤维细胞及其分泌的细胞外基质沉积，从而导致HS的形成。如何从细胞数量上抑制其增殖是本实验研究的重点。
4.2 中医认为，瘢痕的形成多由风火气郁，痰湿凝聚，气滞血瘀，余毒搏于肌肤所致。黑布药膏是赵炳南的经验方，其组成为：老黑醋250g，五倍子100g，蜈蚣1.2g，蜂蜜100g。方中老黑醋软坚解毒，五倍子收敛解毒，蜈蚣破瘀解毒，蜂蜜调和诸药，共奏破瘀软坚之功效。
4.3 PCNA是一种相对分子质量为32736～35712的核蛋白，是一种细胞周期调节蛋白，直接参与DNA的合成，PCNA的出现明显与细胞增殖有关，在静止细胞，其量很少，G1期增加，S期达到高峰，G2、M期明显下降[2]。PCNA在DNA复制过程中起重要作用。PCNA的表达已证实与细胞的增殖状态密切相关[3]。若通过某种物理的或化学的手段来减少PCNA的含量，则加快HS的消退。
4.4 本实验研究结果表明，黑布药膏治疗兔耳HS是有效的。瘢痕形成基础是成纤维细胞增殖和胶原的过度沉积，经黑布药膏治疗后，SEI和NA下降，说明黑布药膏可以抑制成纤维细胞增殖和胶原合成。HS组织真皮层及表皮角质层见大量PCNA阳性表达细胞，其阳性细胞率较正常皮肤明显增高，表明HS的形成与创伤修复过程中成纤维细胞的增殖活性增高有关，大量增殖活跃的成纤维细胞及其所分泌的胶原等细胞外基质构成HS形成的物质基础。黑布药膏治疗组PCNA阳性细胞率较正常组明显减少，说明黑布药膏对可抑制呈增殖活性的HS成纤维细胞，使其DNA的合成明显减少，增殖受阻。为深入研究黑布药膏对HS的作用机制及临床应用提供了理论和实验依据。
[参考文献]
[1]赵丽,王莹,关洪全. 黑布药膏对兔耳增生性瘢痕Bax和Bcl-2 m RNA表达的影响[J].中国美容医学,2011,20(6):764-766.
[2]Oqata K,Oqata Y,Nakamura RM,et a1．Purification and N-terminal amino acid sequence of proliferating cell nuclear antigen(PCNA)/cyclin and development of ELISA for anti-PCNA antibodies[J].J lmmunol,1985,135(4)：2623-2627.
[3]Prelich G,Tan CK,Kostura M,et al.Functional identity of proliferating cell nuclear antigen and a DNA polymerase-delta auxiliary protein[J].Nature,1987,326(6112):517-20.
[收稿日期]2011-04-25 [修回日期]2011-06-14
编辑/张惠娟
[关键词]黑布药膏；兔耳增生性瘢痕；成纤维细胞；细胞增殖
[中图分类号]R619+.6[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2011）07-1103-03
Effectiveness of Heibu ointment on the hypertrophic scarring in the rabbit ears by histomorpology
ZHAO Li,LIU Bo,ZHOU Xiao-hong
(Liaoning College of Health Vocational Technology,Shenyang 110101,Liaoning,China)
Abstract:0bjectiveTo investigate the effect of Heibu ointment on proliferative activity offibroblasts in the hypetrrophic scarring models in rabbitears．MethodsTwenty-four white rabbits were used to establish the models of hypertrophic scar in ears．After twenty-one days, the modles were randomly divided into Heibuointment treatment group and modle group，Heibuointment was plastered on the hypetrrophic scarring ofHeibuointment treatmentgroup once every three days. The material was respectively taken on the second, the fourth, the sixth and the eighth week, to study the changes of fibroblasts with Heibu ointment and compare with the controls during the process of forming hypertrophic scars. Observe the scars morphology by HE staining technique, calculate the scar elevation index and density of fibroblasts；The expression of proliferation cell nuclear antigen (PCNA) protein was measured by immunohistochemistry technique.ResultsTheexpressionofPCNA ofHeibuointment treatmentgroup was viously weaker than the controls(P<0.05). Heibuointment couldreduce the scar elevation index and density of fibroblasts (P<0.05).ConculusionHeibuointment couldinhibitthe proliferationof fibroblasts inhypertrophicscarsof rabbitears.
Key words:Heibu ointment;hypertrophic scarring of rabbit ear;fibroblast；cell proliferation
增生性瘢痕(Hypertrophicscar，HS)是病理性瘢痕的一种，是皮肤真皮损伤愈合后遗留的高出周围正常皮肤、发红、坚硬的病理结构，可以出现瘙痒、疼痛等不适症状。临床用黑布药膏治疗增生性瘢痕疗效确切，但其作用机理一直未见报道，本实验用黑布药膏治疗兔耳增生性瘢痕，通过与对照组比较瘢痕增生指数、成纤维细胞密度和增殖细胞核抗原蛋白表达，来研究黑布药膏对兔耳增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响，探讨其对增生性瘢痕的作用机制。
1材料
1.1动物与药物：同参考文献[1]。
1.3 试剂与器材：明胶、苏木素-伊红染液、50%硝酸溶液、1%甲酸溶液、OLYMPUS光学显微镜、LKB超薄切片机、计算机图像分析系统均由中国医科大学组胚教研室提供。鼠抗兔PCNA单克隆抗体（批号为BM0104），SABC试剂盒（批号为SA1020），DAB显色试剂盒（批号为AR1020），均购于武汉博士德生物工程有限公司。
2方法
2.1分组与造模：分组、造模方法、给药方法及取材方法同参考文献[1]，各组组织均4%多聚甲醛固定48h后常规脱水，石蜡包埋，连续切片，厚度为3～5μm。
2.2观察指标
2.2.1瘢痕增生指数（Scar elevation index，SEI）：HE染色切片，低倍镜下用纤维测量尺测量，计算瘢痕增生指数。按公式SEI=A/B计算瘢痕增生指数。A=瘢痕凸起最高点至耳软骨表面的垂直高度；B=瘢痕周边正常皮肤皮缘至耳软骨表面的垂直高度。
2.2.2成纤维细胞密度(density of fibroblasts，NA)：HE染色切片，400倍光镜下观察, 在瘢痕中央浅部、中央深部、两侧部各随机选取10个矩形视野，目测计数并计算单位面积内成纤维细胞的数量，结果取均数。
2.2.3 PCNA蛋白测定：应用常规2步免疫组化法，按试剂盒说明书操作。以PBS代替一抗作为阴性对照，细胞核内含有棕黄色颗粒者为阳性细胞。在400倍光镜下观察结果，每张切片找5个阳性细胞最多的视野进行计数，阳性细胞反应率=阳性细胞数/细胞总数×100%，结果取均数。
2.3统计学处理：数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较用t检验，采用 SPSS13.0进行数据处理，P＜0.05为差异有显著意义。
3结果
3.1 瘢痕增生指数的比较：黑布药膏可降低瘢痕增生指数，从上皮化第4周开始治疗组与模型组有显著性差异（P＜0.01），并随着时间推移，瘢痕增生指数降低愈加明显，见表1。
3.2 成纤维细胞密度的比较：模型组成纤维细胞密度明显高于正常组，与正常组比较有显著性差异（P＜0.01），在上皮化后4周达到最高值，之后逐渐降低。黑布药膏可降低成纤维细胞密度，与模型组比较有显著性差异（P＜0.05），见表2。
3.3 PCNA检测结果：正常皮肤表皮基底细胞层PCNA阳性表达，真皮层阳性表达较少。模型组除基底细胞PCNA阳性表达及部分棘细胞层和颗粒细胞层呈阳性表达外，真皮层见大量PCNA阳性表达细胞，在上皮化后4周达到最高值，与正常组比较有显著性差异(P＜0.01)。黑布药膏治疗组PCNA阳性细胞较模型组明显减少，相比有显著性差异(P＜0.01)，见表2。
4讨论
4.1 HS是皮肤创伤后组织过度修复的结果，其特征为大量结缔组织基质、尤其是胶原的过度合成与沉积，而成纤维细胞是产生胶原等细胞外基质的功能性细胞，成纤维细胞的过度增殖导致大量成纤维细胞及其分泌的细胞外基质沉积，从而导致HS的形成。如何从细胞数量上抑制其增殖是本实验研究的重点。
4.2 中医认为，瘢痕的形成多由风火气郁，痰湿凝聚，气滞血瘀，余毒搏于肌肤所致。黑布药膏是赵炳南的经验方，其组成为：老黑醋250g，五倍子100g，蜈蚣1.2g，蜂蜜100g。方中老黑醋软坚解毒，五倍子收敛解毒，蜈蚣破瘀解毒，蜂蜜调和诸药，共奏破瘀软坚之功效。
4.3 PCNA是一种相对分子质量为32736～35712的核蛋白，是一种细胞周期调节蛋白，直接参与DNA的合成，PCNA的出现明显与细胞增殖有关，在静止细胞，其量很少，G1期增加，S期达到高峰，G2、M期明显下降[2]。PCNA在DNA复制过程中起重要作用。PCNA的表达已证实与细胞的增殖状态密切相关[3]。若通过某种物理的或化学的手段来减少PCNA的含量，则加快HS的消退。
4.4 本实验研究结果表明，黑布药膏治疗兔耳HS是有效的。瘢痕形成基础是成纤维细胞增殖和胶原的过度沉积，经黑布药膏治疗后，SEI和NA下降，说明黑布药膏可以抑制成纤维细胞增殖和胶原合成。HS组织真皮层及表皮角质层见大量PCNA阳性表达细胞，其阳性细胞率较正常皮肤明显增高，表明HS的形成与创伤修复过程中成纤维细胞的增殖活性增高有关，大量增殖活跃的成纤维细胞及其所分泌的胶原等细胞外基质构成HS形成的物质基础。黑布药膏治疗组PCNA阳性细胞率较正常组明显减少，说明黑布药膏对可抑制呈增殖活性的HS成纤维细胞，使其DNA的合成明显减少，增殖受阻。为深入研究黑布药膏对HS的作用机制及临床应用提供了理论和实验依据。
[参考文献]
[1]赵丽,王莹,关洪全. 黑布药膏对兔耳增生性瘢痕Bax和Bcl-2 m RNA表达的影响[J].中国美容医学,2011,20(6):764-766.
[2]Oqata K,Oqata Y,Nakamura RM,et a1．Purification and N-terminal amino acid sequence of proliferating cell nuclear antigen(PCNA)/cyclin and development of ELISA for anti-PCNA antibodies[J].J lmmunol,1985,135(4)：2623-2627.
[3]Prelich G,Tan CK,Kostura M,et al.Functional identity of proliferating cell nuclear antigen and a DNA polymerase-delta auxiliary protein[J].Nature,1987,326(6112):517-20.
[收稿日期]2011-04-25 [修回日期]2011-06-14
编辑/张惠娟