【摘 要】
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目的:构建表达虫荧光色素酶报告基因重组腺病毒载体,为腺病毒中和抗体流行水平的定量检测奠定基础.方法:采用腺病毒表达系统(ViraPower Adenoviral Expression System)构建重
【机 构】
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山东医学高等专科学校免疫学实验室,山东,临沂,276002;南京医科大学医学检验系,江苏,南京,210029
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目的:构建表达虫荧光色素酶报告基因重组腺病毒载体,为腺病毒中和抗体流行水平的定量检测奠定基础.方法:采用腺病毒表达系统(ViraPower Adenoviral Expression System)构建重组腺病毒表达载体.首先利用PCR的方法扩增虫荧光色素酶基因使其具备特定的CACC接头,以连接、转化、提取质粒等方法克隆人载体pENTR/D-TOPO以获得入门克隆,经PCR及测序鉴定正确后,用重组酶(LR ClonaseTMⅡ Enzyme Mix)进行入门克隆与表达载体(pAd-CMV/V5-DEST)间的重组反应,以获得表达克隆rAd-Luci.表达克隆鉴定后,用限制性内切酶Pac Ⅰ线性化后转染HEK293A包装细胞得到重组腺病毒.经过扩增后,用极限稀释法检测病毒滴度,用Western blot法检测rAd-Luci载体是否能正确表达虫荧光色素酶蛋白,并检测此酶蛋白的功能活性.结果:用PCR的方法扩增到具有CACC接头的虫荧光色素酶基因,其重组入门和腺病毒表达克隆经PCR和测序鉴定构建正确,重组表达克隆转染HEK293A细胞并扩增后获得的病毒滴度为1.8×1011 pfu/ml,此病毒能正确表达虫荧光色素酶蛋白,并且具有较强的功能活性.结论:成功构建了虫荧光色素酶报告基因重组腺病毒载体,为此重组载体用于腺病毒中和抗体的定量检测奠定基础.
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