【摘 要】
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目的: 构建并表达抗人血管内皮生长因子受体KDR单链抗体(scFv)蛋白, 并测定其生物学活性.方法: 设计合成抗KDR单抗(mAb)Ycom1D3 VH、VL引物, 通过重叠延伸拼接(splicing over
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目的: 构建并表达抗人血管内皮生长因子受体KDR单链抗体(scFv)蛋白, 并测定其生物学活性.方法: 设计合成抗KDR单抗(mAb)Ycom1D3 VH、VL引物, 通过重叠延伸拼接(splicing overlap extensive, SOE)PCR, 在VH和VL基因间引入柔性短肽(Gly4Ser)3, 构建抗KDR scFv基因并进行序列分析.将其克隆入pAYZH原核表达载体, 在大肠杆菌中诱导表达, 并以ELISA及免疫荧光结合实验测定重组蛋白的生物学活性.结果: 序列分析表明, 抗KDR scFv基因的全长为729 bp, 编码243个氨基酸.将重组体表达产物进行SDS-PAGE及Western blot分析显示, 融合蛋白的相对分子质量(Mr)约为30 000, 同预期的结果一致.表达产物主要以不溶性包涵体的形式存在, 表达量占菌体总蛋白的20%.表达产物经变性、纯化及体外复性后, 纯度达90%以上.ELISA和竞争性免疫荧光结合实验显示, 重组小分子scFv可与可溶性KDR抗原及表达KDR受体的人脐静脉内皮细胞特异性结合, 保留了亲本mAb的抗原结合活性.结论: 成功地构建了抗KDR scFv基因, 并在大肠杆菌中功能性表达, 为靶向诊断、 治疗及进一步基因工程改造奠定了基础.
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