【摘 要】
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目的 研究微小RNA-22(miR-22)靶向核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)在巨噬细胞RAW264.7清除结核分枝杆菌(MTB)中的作用.方法 体外培养RAW264.7巨噬细胞,分为miR-22
【机 构】
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5630001,遵义医科大学附属医院呼吸与危重症医学科;6413012,资阳市第一人民医院感染科
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目的 研究微小RNA-22(miR-22)靶向核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)在巨噬细胞RAW264.7清除结核分枝杆菌(MTB)中的作用.方法 体外培养RAW264.7巨噬细胞,分为miR-22 mimic+NLRP3-WT组、miR-22 NC+NLRP3-WT组、miR-22 mimic+NLRP3-MUT组和miR-22 NC+NLRP3-MUT组.采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-22与NLRP3基因的靶向关系.采用MTB标准菌株H37Rv感染RAW264.7巨噬细胞,分为NC组(正常生长RAW264.7巨噬细胞)、H37Rv组(感染H37Rv的RAW264.7巨噬细胞)、H37Rv+ mimic NC组(H37Rv组基础上转染miR-22 mimic NC序列)和H37Rv+mimic组(H37Rv组基础上转染miR-22 mimic序列),采用流式细胞仪检测RAW264.7巨噬细胞微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)+、MTB抗原Ag85A+(Ag85A+);采用实时定量PCR(RT-qPCR)检测RAW264.7巨噬细胞中miR-22、NLRP3 mRNA表达水平;采用免疫印迹(WB)检测RAW264.7巨噬细胞中NLRP3、半胱天冬氨酸蛋白酶-1(caspase-1)蛋白表达水平;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测RAW264.7巨噬细胞上清液中白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-18水平.结果 双荧光素酶报告基因实验结果显示,与miR-22 NC+ NLRP3-WT组比较,miR-22 mimic+NLRP3-WT组荧光素酶相对活性显著降低(P＜0.05);miR-22 mimic+NLRP3-MUT组、miR-22 NC+NLRP3-MUT组荧光素酶相对活性差异无统计学意义(P＞0.05).与NC组比较,H37Rv组RAW264.7巨噬细胞miR-22水平、LC3-Ⅱ+细胞比例显著降低(P＜0.05),Ag85A+细胞比例、NLRP3水平、caspase-1、IL-1β、IL-18水平显著增加(P＜0.05);与H37Rv+ mimic NC组比较,H37Rv+ mimic组RAW264.7巨噬细胞miR-22水平、LC3-Ⅱ+细胞比例增加(P＜0.05),Ag85A+细胞比例、NLRP3水平、caspase-1、IL-1β、IL-18水平显著降低(P＜0.05).结论 miR-22通过靶向抑制NLRP3表达,促进巨噬细胞清除结核分枝杆菌,可能与促进细胞自噬有关.
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