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摘?要 参照GeneBank上产气荚膜梭菌肠毒素（cpe）基因序列，设计合成一对特异性引物，采用PCR技术对产气荚膜梭菌C型分离株进行扩增，将扩增产物连接到pMD18-T载体，转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞，提取质粒进行PCR和双酶切鉴定后测序，结果显示：产气荚膜梭菌C型分离株cpe基因全长960bp，可编码319个氨基酸；与参考株核苷酸同源性为99.4％～99.8％，氨基酸同源性为99.1％～99.7％。
关键词 产气荚膜梭菌；肠毒素基因；克隆；序列分析
中图分类号 S852 文献标识码 A 文章编号 1673-9671-(2012)072-0172-02
产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）是一种温和厌氧的梭状芽孢杆菌，广泛分布于土壤、污水、饲料、食物、人畜粪便及肠道中，能引起人类气性坏疽及多种动物肠毒血症和坏死性肠炎。产气荚膜梭菌能产生15种以上外毒素及侵袭性酶类，根据其产生的四种主要致死性毒素即α、β、ε和ι毒素的差异，可将产气荚膜梭菌分为A～E五种血清型。产气荚膜梭菌肠毒素（Clostridium perfringens enterotoxin，CPE）主要是由A型产气荚膜梭菌产生，部分C型和D型菌也可以产生，是一种对热和PH均不稳定的蛋白，分子量为35KD。据报道，仅有少数产气荚膜梭菌(约5%）带有cpe基因，并且大部分cpe阳性分离株都来自人食物中毒病例。携带CPE的A型产气荚膜梭菌是引起产气荚膜梭菌性食物中毒的主要病原，该种食物中毒数已占整个食物中毒病例总数的第二位。本试验验对产气荚膜梭菌C型cpe基因进行了克隆测序分析，以期为产气荚膜梭菌肠毒素所致疾病的诊断与控制提供一些依据。
1 材料和方法
1.1 菌株及载体
含cpe基因产气荚膜梭菌A型菌株（NCTC64609）为广州市疾病预防控制中心邓志爱老师惠赠；产气荚膜梭菌C型分离株（CP2）由贵州大学文明老师惠赠；宿主菌DH5a和pMD18-T vector购自大连宝生物工程有限公司；其它试剂均为分析纯。
1.2 主要试剂
PCR试剂、200bp Markers、EB、酚/氯仿/异戊醇等，购自上海生物工程公司；凝胶回收试剂盒、限制性核酸内切酶（EcoRⅠ和BamHⅠ）、X-gal、IPTG、RNase等，购自大连宝生物工程有限公司；细菌培养基，购自杭州微生物试剂有限公司。
1.3 cpe基因引物设计与合成
参照GeneBank上产气荚膜梭菌cpe基因序列设计特异性引物P1和P2(P1:5’-TTAGGATCCATGCTTAGTAACAATTTAAATCC-3’/P2:5’-GGG GAATTCTTAAAATTTTTGAAATAATATTGA-3’， 黑斜体表示酶切位点），预期扩幅为960bp，由上海生物工程技术有限公司合成。
1.4 菌株复苏与DNA提取
取产气荚膜梭菌A型标准株（NCTC64609）及C型分离株分别接种厌氧肉肝汤培养基，37℃厌氧培养24 h后，取其培养物1.0 mL，8000 r/min离心5 min，弃上清，加入200 μL灭菌双蒸水，水浴加热15～20 min，8000 r/min离心5 min，取上清即为细菌DNA模板。
1.5 cpe基因PCR扩增
建立50 μL PCR反应体系，即10×Buffer缓冲液5.0 μL、MgCl2 （2.5 mmol/L）4.0 μL、dNTP（10 mM） 1.0 μL、模板5.0 μL和上下游引物（10 μmol/L）各2.0 μL、Taq DNA聚合酶（2.5U）1.0 μL，加灭菌双蒸水补至50 μL。PCR反应条件：94℃预变性5 min；前5个循环的扩增条件为94℃ 30 s、40℃ 30 s、72℃ 80 s，然后按94℃ 30 s、50℃ 30s、72℃ 80 s进行25个循环；72℃延伸10 min。取PCR产物8.0 μL于1.0%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果。
1.6 cpe基因回收、转化与鉴定
采用DNA胶回收试剂盒回收PCR产物，与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，经含Amp、X-gal和IPTG平板培养筛选，挑取白色菌落，在含Amp的LB液体培养基培养过夜，用SDS碱裂解法提取重组质粒，采用PCR与双酶切鉴定，筛选阳性重组质粒。
1.7 序列测定与分析
取阳性重组质粒送至大连宝生物公司测序，应用DNAMAN软件进行核苷酸与氨基酸序列同源性分析，Clustalx1.83和mega3软件构建cpe基因系统发生树。
2 结果
2.1 产气荚膜梭菌C型菌cpe基因PCR扩增结果
经PCR检测发现，产气荚膜梭菌C型分离株可扩增出一条约960 bp大小的DNA条带，与产气荚膜梭菌A型标准株（NCTC64609）的扩增产物大小基本一致（见图1）。
N: Blank Control；
1: Cl. perfringens cpe Type C isolates；
2: Cl. perfringens cpe type A (NCTC64609)；
M: 200bp Markers
图1 产气荚膜梭菌C型cpe 基因PCR扩增结果
2.2 含cpe基因重组质粒鉴定
取产气荚膜梭菌C型分离株PCR产物，与pMD18-T载体连接并转化后，挑取白色菌落，过夜摇菌，提取质粒，经PCR和双酶切鉴定显示，所选菌落为阳性重组质粒（见图2）。
2.3 cpe基因序列测定与分析
测序显示产气荚膜梭菌C型分离株肠毒素基因全长960bp，可编码319个氨基酸。采用DNAMAN软件分析发现，产气荚膜梭菌C型分离株肠毒素基因与参考株核苷酸同源性为99.4％～99.8％，氨基酸同源性为99.1％～99.7％（见表1）。运用Clustalx1.83和mega3绘制系统发生树发现，产气荚膜梭菌C型分离株（CP2）肠毒素基因与参考株的亲缘关系均很近（见图3）。 1: The digested results of the recombinant plasmid；
2: Control of the recombinant plasmid；
3: PCR result of the recombinant plasmid；
M: 200bp Markers
图2 重组质粒鉴定结果
图3 产气荚膜梭菌肠毒素基因系统发生树
3 讨论与分析
产气荚膜梭菌是一种重要的人畜共患病病原，可引起多种动物肠毒血症和坏死性肠炎，也是一种比较常见的食物中毒致病菌，广泛分布于自然界（水源、土壤等)及人和动物肠道中。肠毒素（Clostridium perfringens enterotoxin，CPE）主要由A型产气荚膜梭菌在芽孢期产生的一种毒素，部分C型和D型菌也能产生，是产气荚膜梭菌一个非常重要的致病毒素，在引起人和动物胃肠疾病方面起着关键性的作用。本研究根据cpe开放阅读框设计并合成合成1对引物，运用PCR方法进行扩增，成功克隆出了C型产气荚膜梭菌肠毒素基因，经同源性和进化树分析发现，C型产气荚膜梭菌分离株与参考株同源性达99.4％～99.8％，与参考株间亲缘关系均较近，可见cpe在产气荚膜梭菌中是相对稳定或保守的。这些研究，为产气荚膜梭菌肠毒素所致疾病的诊断与控制提供依据。
参考文献
[1]W Muller.Bovine Paraqplegic Syndrome (Mal de Aquidaban) in Paraguay caused by Clostridium welchiierfringens Toxovar[M].D.Berl Muech Tieraeztl Wschr,1998,2:23.
[2]Shauna G, Sparks SG, Carman RJ，et a1. Genotyping of enterotoxigenic Clostridium perfringens fecal isolates associated with antibiotic-associated diarrhea and food poisoning in North America[J]. J Clin Microbiol,2001,39(3):883-888.
[3]J.G.SmedleyⅢ, D.J.Fisher, S.Sayeed, et al.The enteric toxins of Clostridium perfringens[J]. Rev Physiol Biochem Pnarmacol, 2004, 152:183-204.
[4]JOHN F. KOKAI-KUN, KIMBERLY BENTON, EVA U. WIECKOWSKI, et al.Identification of a Clostridium perfringens Enterotoxin Region Required for Large Complex Formation and Cytotoxicity by Random Mutagenesis[J].INFECTION AND IMMUNITY, 1999,67(11): 5634V- 5641.
[5]Gibert M, Jolivet-Reynaud C, Popoff M R, et a1. Beta2 toxin，a novel toxin produced by Clostridium perfringens[J]. Gene,1997,203:65-73.
[6]Goswami P P, Girish K S, Chaudhuri P. et a1.Cloning and sequencing of beta toxin gene of Clostridium perfringens type C [J].Indian J Exp Biol,2002,40:109-10.
[7]Goswami P P, Rupa P, Prihar N S, et a1. Molecular cloning of Clostridium perfringens epsilon·toxin gene and its high level expression in E.coli[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1996,226:735-40.
[8]Hunter S E, Clarke I N, Kelly D C,et a1. Cloning and nudeotide sequencing of the Clostridium perfringens epsilon-toxin gene and its expression in Escherichia coli．Infect Immun,1992,60:102-10.
[9]文其乙,刘秀梵,Werner Phillip,等.多重聚合酶链反应检测环境中产气荚膜杆菌[J].畜报,2002,33(6):623-626.
[10]JOHN R.CZECZULIN, PHILIP CV.HANNA, BRUCE A.McCLANE . Cloning, Nucleotide Sequencing, and Expression of the Clostridium perfringens Eenterotoxin Gene in Escherichia coli[J].INFECTION AND IMMUNITY, 1993,61(8): 3429- 3439.
[11]Miwa Norinaga, Takashi Masuda, Katsuya Terai, et al. Bacteriological investigation of an outbreak of Clostridium perfringens food poisoning caused by Japanese food without animal protein[J]. International Journal of Food Microbiology, 1999, 49: 103-106.
作者简介
秦雯（1983—），女，汉族，助教，贵阳护理职业学院，研究方向：卫生检验与检疫技术。
关键词 产气荚膜梭菌；肠毒素基因；克隆；序列分析
中图分类号 S852 文献标识码 A 文章编号 1673-9671-(2012)072-0172-02
产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）是一种温和厌氧的梭状芽孢杆菌，广泛分布于土壤、污水、饲料、食物、人畜粪便及肠道中，能引起人类气性坏疽及多种动物肠毒血症和坏死性肠炎。产气荚膜梭菌能产生15种以上外毒素及侵袭性酶类，根据其产生的四种主要致死性毒素即α、β、ε和ι毒素的差异，可将产气荚膜梭菌分为A～E五种血清型。产气荚膜梭菌肠毒素（Clostridium perfringens enterotoxin，CPE）主要是由A型产气荚膜梭菌产生，部分C型和D型菌也可以产生，是一种对热和PH均不稳定的蛋白，分子量为35KD。据报道，仅有少数产气荚膜梭菌(约5%）带有cpe基因，并且大部分cpe阳性分离株都来自人食物中毒病例。携带CPE的A型产气荚膜梭菌是引起产气荚膜梭菌性食物中毒的主要病原，该种食物中毒数已占整个食物中毒病例总数的第二位。本试验验对产气荚膜梭菌C型cpe基因进行了克隆测序分析，以期为产气荚膜梭菌肠毒素所致疾病的诊断与控制提供一些依据。
1 材料和方法
1.1 菌株及载体
含cpe基因产气荚膜梭菌A型菌株（NCTC64609）为广州市疾病预防控制中心邓志爱老师惠赠；产气荚膜梭菌C型分离株（CP2）由贵州大学文明老师惠赠；宿主菌DH5a和pMD18-T vector购自大连宝生物工程有限公司；其它试剂均为分析纯。
1.2 主要试剂
PCR试剂、200bp Markers、EB、酚/氯仿/异戊醇等，购自上海生物工程公司；凝胶回收试剂盒、限制性核酸内切酶（EcoRⅠ和BamHⅠ）、X-gal、IPTG、RNase等，购自大连宝生物工程有限公司；细菌培养基，购自杭州微生物试剂有限公司。
1.3 cpe基因引物设计与合成
参照GeneBank上产气荚膜梭菌cpe基因序列设计特异性引物P1和P2(P1:5’-TTAGGATCCATGCTTAGTAACAATTTAAATCC-3’/P2:5’-GGG GAATTCTTAAAATTTTTGAAATAATATTGA-3’， 黑斜体表示酶切位点），预期扩幅为960bp，由上海生物工程技术有限公司合成。
1.4 菌株复苏与DNA提取
取产气荚膜梭菌A型标准株（NCTC64609）及C型分离株分别接种厌氧肉肝汤培养基，37℃厌氧培养24 h后，取其培养物1.0 mL，8000 r/min离心5 min，弃上清，加入200 μL灭菌双蒸水，水浴加热15～20 min，8000 r/min离心5 min，取上清即为细菌DNA模板。
1.5 cpe基因PCR扩增
建立50 μL PCR反应体系，即10×Buffer缓冲液5.0 μL、MgCl2 （2.5 mmol/L）4.0 μL、dNTP（10 mM） 1.0 μL、模板5.0 μL和上下游引物（10 μmol/L）各2.0 μL、Taq DNA聚合酶（2.5U）1.0 μL，加灭菌双蒸水补至50 μL。PCR反应条件：94℃预变性5 min；前5个循环的扩增条件为94℃ 30 s、40℃ 30 s、72℃ 80 s，然后按94℃ 30 s、50℃ 30s、72℃ 80 s进行25个循环；72℃延伸10 min。取PCR产物8.0 μL于1.0%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果。
1.6 cpe基因回收、转化与鉴定
采用DNA胶回收试剂盒回收PCR产物，与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，经含Amp、X-gal和IPTG平板培养筛选，挑取白色菌落，在含Amp的LB液体培养基培养过夜，用SDS碱裂解法提取重组质粒，采用PCR与双酶切鉴定，筛选阳性重组质粒。
1.7 序列测定与分析
取阳性重组质粒送至大连宝生物公司测序，应用DNAMAN软件进行核苷酸与氨基酸序列同源性分析，Clustalx1.83和mega3软件构建cpe基因系统发生树。
2 结果
2.1 产气荚膜梭菌C型菌cpe基因PCR扩增结果
经PCR检测发现，产气荚膜梭菌C型分离株可扩增出一条约960 bp大小的DNA条带，与产气荚膜梭菌A型标准株（NCTC64609）的扩增产物大小基本一致（见图1）。
N: Blank Control；
1: Cl. perfringens cpe Type C isolates；
2: Cl. perfringens cpe type A (NCTC64609)；
M: 200bp Markers
图1 产气荚膜梭菌C型cpe 基因PCR扩增结果
2.2 含cpe基因重组质粒鉴定
取产气荚膜梭菌C型分离株PCR产物，与pMD18-T载体连接并转化后，挑取白色菌落，过夜摇菌，提取质粒，经PCR和双酶切鉴定显示，所选菌落为阳性重组质粒（见图2）。
2.3 cpe基因序列测定与分析
测序显示产气荚膜梭菌C型分离株肠毒素基因全长960bp，可编码319个氨基酸。采用DNAMAN软件分析发现，产气荚膜梭菌C型分离株肠毒素基因与参考株核苷酸同源性为99.4％～99.8％，氨基酸同源性为99.1％～99.7％（见表1）。运用Clustalx1.83和mega3绘制系统发生树发现，产气荚膜梭菌C型分离株（CP2）肠毒素基因与参考株的亲缘关系均很近（见图3）。 1: The digested results of the recombinant plasmid；
2: Control of the recombinant plasmid；
3: PCR result of the recombinant plasmid；
M: 200bp Markers
图2 重组质粒鉴定结果
图3 产气荚膜梭菌肠毒素基因系统发生树
3 讨论与分析
产气荚膜梭菌是一种重要的人畜共患病病原，可引起多种动物肠毒血症和坏死性肠炎，也是一种比较常见的食物中毒致病菌，广泛分布于自然界（水源、土壤等)及人和动物肠道中。肠毒素（Clostridium perfringens enterotoxin，CPE）主要由A型产气荚膜梭菌在芽孢期产生的一种毒素，部分C型和D型菌也能产生，是产气荚膜梭菌一个非常重要的致病毒素，在引起人和动物胃肠疾病方面起着关键性的作用。本研究根据cpe开放阅读框设计并合成合成1对引物，运用PCR方法进行扩增，成功克隆出了C型产气荚膜梭菌肠毒素基因，经同源性和进化树分析发现，C型产气荚膜梭菌分离株与参考株同源性达99.4％～99.8％，与参考株间亲缘关系均较近，可见cpe在产气荚膜梭菌中是相对稳定或保守的。这些研究，为产气荚膜梭菌肠毒素所致疾病的诊断与控制提供依据。
参考文献
[1]W Muller.Bovine Paraqplegic Syndrome (Mal de Aquidaban) in Paraguay caused by Clostridium welchiierfringens Toxovar[M].D.Berl Muech Tieraeztl Wschr,1998,2:23.
[2]Shauna G, Sparks SG, Carman RJ，et a1. Genotyping of enterotoxigenic Clostridium perfringens fecal isolates associated with antibiotic-associated diarrhea and food poisoning in North America[J]. J Clin Microbiol,2001,39(3):883-888.
[3]J.G.SmedleyⅢ, D.J.Fisher, S.Sayeed, et al.The enteric toxins of Clostridium perfringens[J]. Rev Physiol Biochem Pnarmacol, 2004, 152:183-204.
[4]JOHN F. KOKAI-KUN, KIMBERLY BENTON, EVA U. WIECKOWSKI, et al.Identification of a Clostridium perfringens Enterotoxin Region Required for Large Complex Formation and Cytotoxicity by Random Mutagenesis[J].INFECTION AND IMMUNITY, 1999,67(11): 5634V- 5641.
[5]Gibert M, Jolivet-Reynaud C, Popoff M R, et a1. Beta2 toxin，a novel toxin produced by Clostridium perfringens[J]. Gene,1997,203:65-73.
[6]Goswami P P, Girish K S, Chaudhuri P. et a1.Cloning and sequencing of beta toxin gene of Clostridium perfringens type C [J].Indian J Exp Biol,2002,40:109-10.
[7]Goswami P P, Rupa P, Prihar N S, et a1. Molecular cloning of Clostridium perfringens epsilon·toxin gene and its high level expression in E.coli[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1996,226:735-40.
[8]Hunter S E, Clarke I N, Kelly D C,et a1. Cloning and nudeotide sequencing of the Clostridium perfringens epsilon-toxin gene and its expression in Escherichia coli．Infect Immun,1992,60:102-10.
[9]文其乙,刘秀梵,Werner Phillip,等.多重聚合酶链反应检测环境中产气荚膜杆菌[J].畜报,2002,33(6):623-626.
[10]JOHN R.CZECZULIN, PHILIP CV.HANNA, BRUCE A.McCLANE . Cloning, Nucleotide Sequencing, and Expression of the Clostridium perfringens Eenterotoxin Gene in Escherichia coli[J].INFECTION AND IMMUNITY, 1993,61(8): 3429- 3439.
[11]Miwa Norinaga, Takashi Masuda, Katsuya Terai, et al. Bacteriological investigation of an outbreak of Clostridium perfringens food poisoning caused by Japanese food without animal protein[J]. International Journal of Food Microbiology, 1999, 49: 103-106.
作者简介
秦雯（1983—），女，汉族，助教，贵阳护理职业学院，研究方向：卫生检验与检疫技术。