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【摘 要】目的：探究类风湿关节炎患者外周血调节性T细胞（Treg细胞）分泌白细胞介素-35（IL-35）水平与其发病的相关性。方法：选取类风湿关节炎患者70例作为观察组，健康体检者70例为对照组。采集2组外周血，检测Treg细胞数量、Foxp3荧光强度、IL-35水平。同时将观察组患者按照28个关节疾病活动度评分（DAS28评分）分为不同的组，对各组Treg细胞、Foxp3荧光强度、IL-35水平进行检测。结果：观察组患者外周血中Treg细胞高于对照组，IL-35水平低于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）;
2组Foxp3荧光强度比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。各DAS28评分组RA患者的Treg细胞、IL-35水平比较，差异有统计学意义（P < 0.05），且DAS28评分越高，Treg细胞数量和IL-35水平越低;各DAS28评分组RA患者Foxp3荧光强度比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。结论：类风湿关节炎患者外周血中Treg细胞数量明显上升，IL-35水平显著下降。由于Treg细胞功能缺陷，降低了负调控能力。
【關键词】 类风湿关节炎;外周血调节性T细胞;白细胞介素-35;相关性
The Correlation Between the Level of IL-35 Secreted by Treg Cells in Peripheral Blood and the Pathogenesis of Rheumatoid Arthritis
LI Dan，SHI Hong，KONG Xiang-hong，ZHANG Jing-li
【ABSTRACT】Objective：To investigate the correlation between the level of IL-35 secreted by Treg cells in peripheral blood and the pathogenesis of rheumatoid arthritis（RA）.Methods：Seventy RA patients were selected as an observation group and 70 healthy physical examinees were selected as a control group.The peripheral blood of both groups was collected.The number of Treg cells，the fluorescence intensity of Foxp3 and the level of IL-35 were measured.At the same time，the patients in the observation group were divided into different groups according to the DAS28 score，and the Treg cells，Foxp3 fluorescence intensity and IL-35 levels in each group were detected.Results：The level of Treg cells in peripheral blood of the observation group was higher than that of the control group，and the level of IL-35 was lower than that of the control group（P < 0.05）;There was no significant difference in the fluorescence intensity of Foxp3 between the two groups（P > 0.05）.The difference of Treg cells and IL-35 levels in RA patients with different DAS28 scores was statistically significant（P < 0.05），and the higher the score of DAS28，the lower the number of Treg cells and IL-35 levels;There was no significant difference in the fluorescence intensity of Foxp3 between RA groups with different DAS28 scores（P > 0.05）.Conclusion：The number of Treg cells in the peripheral blood of RA patients increased significantly，and the level of IL-35 decreased significantly.Because of the deficiency of
Treg cells，the negative regulation ability was reduced.
【Keywords】 rheumatoid arthritis;
Treg cells of peripheral blood;IL-35;correlation
类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）为常见的全身性自身免疫性疾病，主要表现为慢性侵蚀性关节炎。RA患者往往出现关节肿痛、滑膜关节破坏，严重影响患者的正常生活。RA是造成劳动力丧失和致残的一个重要原因。目前，RA的发病机制尚不明确[1-2]。其中，CD4+T细胞亚群失衡、炎症介质异常表达等，对RA发病有重要的作 用[3-4]。CD4+CD25+调节性T细胞（Treg细胞）的两大功能，包括免疫无反应性和免疫应答负调节。CD4+CD25+Treg细胞发挥负调控的作用，对RA的发病和进展产生影响。白细胞介素-35（IL-35）主要由Treg细胞分泌，发挥必需的抑制作用，促使发挥Treg细胞最大抑制效应。IL-35表达缺失，一定程度上影响Treg细胞的抑制功能。本文探究RA患者Treg细胞分泌IL-35水平，及与其发病的相关性，现总结报道如下。
1 临床资料
1.1 一般资料 选取2019年2月到2020年2月
在牡丹江医学院附属红旗医院就诊的RA患者
70例为观察组，同时选取同期健康体检者70例为对照组。观察组男35例，女35例;年龄27～75岁，
平均（63.58±5.21）岁。对照组男36例，女34例;
年龄26～74岁，平均（63.25±5.46）岁。2组在性别、年龄等方面比较，差异无统计学意义
（P > 0.05），具有可比性。本研究经牡丹江医学院附属红旗医院医学伦理委员会批准。
1.2 诊断标准 按照1987年美國风湿病学会（ACR）制定的RA分类标准[5]。
1.3 纳入标准 ①符合上述诊断标准;②签署知情同意书。
1.4 排除标准 ①妊娠或哺乳期妇女;②急慢性感染、肿瘤、冠心病、糖尿病、高血压病等患者;③合
并严重并发症者;④合并其他自身免疫性疾病者。
2 方 法
2.1 试验方法
2.1.1 仪器与试剂 CD25-PE荧光单克隆抗体、人IL-35细胞因子检测试剂盒、人淋巴细胞分离液、牛血清蛋白、酶标仪（美国Becton Dickinson公司）等。
2.1.2 标本采集 采集所有研究对象空腹静脉外周血，抗凝处理后及时进行检测分析。外周血单个核细胞用人淋巴细胞分离液进行分离，PBS清洗重悬，制成细胞悬液，进行流式细胞术检测Treg细胞。对血浆进行离心操作，离心机以3000 r·min-1离心5 min，离心半径5 cm，然后进行细胞因子检测。使用流式上样管，将100 μL外周血单个核细胞悬液、CD4和CD25单抗各6 μL加入后，混合均匀，放置20 min。将BD Cytofix/Cytoperm选取250 μL加入，混合均匀后，放置20 min。将BD Perm/WashTMbuffer加入其中，离心机以1500 r·min-1离心5 min，离心半径6 cm，弃上清液，沾干，重复操作，清洗1次。细胞重悬，加入10 μL Foxp3抗体，放置0.5～1 h，重复操作，清洗2次。弃上清液，在磷酸缓冲盐溶液中细胞重悬，进行检测分析。血浆IL-35水平采用酶联免疫吸附试验进行检测。
2.2 观察指标 观察2组外周血中Treg细胞水平，即Treg细胞（CD4+CD25+Foxp3+T细胞）占CD4+T细胞的百分比;比较观察组不同28个关节疾病活动度评分（DAS28评分）患者的Treg细胞水平，按DAS28评分 < 2.6分、2.6～3.2分、3.3～5.1分、> 5.1分分为4组;比较2组IL-35水平;比较RA患者不同DAS28评分组的IL-35水平。
2.3 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料符合正态分布以表示，采用
t检验，不符合正态分布转换为正态分布后进行分析;计数资料采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
3 结 果
3.1 2组外周血中Treg细胞表达、Foxp3荧光强度比较 观察组外周血中Treg细胞表达高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）;2组Foxp3荧光强度比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。
3.2 2组外周血中IL-35水平比较 观察组外周血中IL-35水平较对照组低，差异有统计学意义
（P < 0.05）。见表2。
3.3 各DAS28评分组RA患者基线资料、Treg细胞表达、Foxp3荧光强度及IL-35水平比较 各DAS28评分组RA患者基线资料比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。不同DAS28评分患者Treg细胞表达比较，差异有统计学意义（P < 0.05），
且DAS28评分越高，Treg细胞表达越低。不同DAS28评分患者Foxp3荧光强度比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。不同DAS28评分患者IL-35水平比较，差异有统计学意义（P < 0.05），且DAS28评分越高，IL-35表达水平越低。见表3。
4 讨 论
RA常出现关节疼痛、僵硬、肿胀等症状，随着疾病的进展，对关节组织造成破坏，影响患者的日常活动。RA发病年龄为40～60岁，患病率为0.32%～0.36%。一般认为，RA与免疫耐受被破坏相关[6-7]。目前，RA的病因和发病机制尚不完全清楚。在健康人群CD4+T细胞中，外周血Treg细胞的比例为5%～10%。Treg细胞具有免疫负调控的作用，对机体自身免疫耐受的维持有重要的意义。Treg细胞的作用主要包括：①表达抑制性转录因子Foxp3;②分泌抑制性细胞因子，如IL-2、IL-10等;③细胞直接接触介导抑制。IL-35是IL-12的家族成员，机体中主要由Treg细胞产生IL-35。IL-12 P35亚基、P35亚基相同，IL-27 EBl3亚基、EBl3亚基相同。构成IL-35亚基的包括EBl3亚基、P35亚基。有研究显示，EBI3-P35-Fc融合蛋白抑制IL-17分泌、Thl7细胞分化，提升γ干扰素水平，促进CD4+CD25+Treg细胞增殖，抑制CD4+CD25-T细胞增殖，改善关节炎症状[8-9]。也有研究显示，由于缺乏IL-35，Treg细胞的抑制功能也会下降[10-13]。有IL-35缺陷的Treg细胞，发挥控制增殖效果，IL-35会抑制CD4+和CD8+ T细胞[14]。
本研究显示，相比健康人群，RA患者的Treg细胞数量明显增加（P < 0.05），但Treg细胞分泌的IL-35比健康人群明显更低（P < 0.05）。提示在RA患者中，IL-35表达下降。IL-35具有负向调控的作用，说明免疫耐受遭到破坏。处于免疫“无能”状态下，RA患者Treg细胞表达上升，免疫负调控功能没有发挥[15-16]。为进一步研究相关情况，对RA患者不同DAS28评分进行分组观察，结果显示，不同DAS28评分患者Treg细胞、IL-35水平比较，差异有统计学意义（P < 0.05）;且DAS28评分越高，Treg细胞数量越低，IL-35水平越低。DAS28评分显示RA病情活动度，DAS28评分越高，表示关节侵蚀较重，疾病活动度越高;DAS28评分越低，显示病情缓解。在疾病活动期一定程度上抑制了外周血Treg细胞数量及功能，机体处于免疫激活状态，降低了其负调控能力，IL-35表达水平也下降。DAS28评分越高，疾病活动度越高。在疾病恢复期，Treg细胞、IL-35功能提升，机体处于免疫抑制状态。RA病程与Treg细胞也有一定的相关性。有研究认为RA患者外周血Treg细胞以及Treg细胞分泌IL-35减少，也有研究认为没有明显变化[17-19]。出现差异的原因，可能是由于某些患者用药物治疗后，对自身抗原的免疫耐受重建，免疫功能改
善[20-23];也可能是不同病程、活动度的影响;也可能是试验样本群的影响。
综上所述，RA患者IL-35水平显著下降，Treg细胞水平提升，Treg细胞及分泌的IL-35与其发生、发展可能相关。
参考文献
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收稿日期：2021-03-09;修回日期：2021-04-21
2组Foxp3荧光强度比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。各DAS28评分组RA患者的Treg细胞、IL-35水平比较，差异有统计学意义（P < 0.05），且DAS28评分越高，Treg细胞数量和IL-35水平越低;各DAS28评分组RA患者Foxp3荧光强度比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。结论：类风湿关节炎患者外周血中Treg细胞数量明显上升，IL-35水平显著下降。由于Treg细胞功能缺陷，降低了负调控能力。
【關键词】 类风湿关节炎;外周血调节性T细胞;白细胞介素-35;相关性
The Correlation Between the Level of IL-35 Secreted by Treg Cells in Peripheral Blood and the Pathogenesis of Rheumatoid Arthritis
LI Dan，SHI Hong，KONG Xiang-hong，ZHANG Jing-li
【ABSTRACT】Objective：To investigate the correlation between the level of IL-35 secreted by Treg cells in peripheral blood and the pathogenesis of rheumatoid arthritis（RA）.Methods：Seventy RA patients were selected as an observation group and 70 healthy physical examinees were selected as a control group.The peripheral blood of both groups was collected.The number of Treg cells，the fluorescence intensity of Foxp3 and the level of IL-35 were measured.At the same time，the patients in the observation group were divided into different groups according to the DAS28 score，and the Treg cells，Foxp3 fluorescence intensity and IL-35 levels in each group were detected.Results：The level of Treg cells in peripheral blood of the observation group was higher than that of the control group，and the level of IL-35 was lower than that of the control group（P < 0.05）;There was no significant difference in the fluorescence intensity of Foxp3 between the two groups（P > 0.05）.The difference of Treg cells and IL-35 levels in RA patients with different DAS28 scores was statistically significant（P < 0.05），and the higher the score of DAS28，the lower the number of Treg cells and IL-35 levels;There was no significant difference in the fluorescence intensity of Foxp3 between RA groups with different DAS28 scores（P > 0.05）.Conclusion：The number of Treg cells in the peripheral blood of RA patients increased significantly，and the level of IL-35 decreased significantly.Because of the deficiency of
Treg cells，the negative regulation ability was reduced.
【Keywords】 rheumatoid arthritis;
Treg cells of peripheral blood;IL-35;correlation
类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）为常见的全身性自身免疫性疾病，主要表现为慢性侵蚀性关节炎。RA患者往往出现关节肿痛、滑膜关节破坏，严重影响患者的正常生活。RA是造成劳动力丧失和致残的一个重要原因。目前，RA的发病机制尚不明确[1-2]。其中，CD4+T细胞亚群失衡、炎症介质异常表达等，对RA发病有重要的作 用[3-4]。CD4+CD25+调节性T细胞（Treg细胞）的两大功能，包括免疫无反应性和免疫应答负调节。CD4+CD25+Treg细胞发挥负调控的作用，对RA的发病和进展产生影响。白细胞介素-35（IL-35）主要由Treg细胞分泌，发挥必需的抑制作用，促使发挥Treg细胞最大抑制效应。IL-35表达缺失，一定程度上影响Treg细胞的抑制功能。本文探究RA患者Treg细胞分泌IL-35水平，及与其发病的相关性，现总结报道如下。
1 临床资料
1.1 一般资料 选取2019年2月到2020年2月
在牡丹江医学院附属红旗医院就诊的RA患者
70例为观察组，同时选取同期健康体检者70例为对照组。观察组男35例，女35例;年龄27～75岁，
平均（63.58±5.21）岁。对照组男36例，女34例;
年龄26～74岁，平均（63.25±5.46）岁。2组在性别、年龄等方面比较，差异无统计学意义
（P > 0.05），具有可比性。本研究经牡丹江医学院附属红旗医院医学伦理委员会批准。
1.2 诊断标准 按照1987年美國风湿病学会（ACR）制定的RA分类标准[5]。
1.3 纳入标准 ①符合上述诊断标准;②签署知情同意书。
1.4 排除标准 ①妊娠或哺乳期妇女;②急慢性感染、肿瘤、冠心病、糖尿病、高血压病等患者;③合
并严重并发症者;④合并其他自身免疫性疾病者。
2 方 法
2.1 试验方法
2.1.1 仪器与试剂 CD25-PE荧光单克隆抗体、人IL-35细胞因子检测试剂盒、人淋巴细胞分离液、牛血清蛋白、酶标仪（美国Becton Dickinson公司）等。
2.1.2 标本采集 采集所有研究对象空腹静脉外周血，抗凝处理后及时进行检测分析。外周血单个核细胞用人淋巴细胞分离液进行分离，PBS清洗重悬，制成细胞悬液，进行流式细胞术检测Treg细胞。对血浆进行离心操作，离心机以3000 r·min-1离心5 min，离心半径5 cm，然后进行细胞因子检测。使用流式上样管，将100 μL外周血单个核细胞悬液、CD4和CD25单抗各6 μL加入后，混合均匀，放置20 min。将BD Cytofix/Cytoperm选取250 μL加入，混合均匀后，放置20 min。将BD Perm/WashTMbuffer加入其中，离心机以1500 r·min-1离心5 min，离心半径6 cm，弃上清液，沾干，重复操作，清洗1次。细胞重悬，加入10 μL Foxp3抗体，放置0.5～1 h，重复操作，清洗2次。弃上清液，在磷酸缓冲盐溶液中细胞重悬，进行检测分析。血浆IL-35水平采用酶联免疫吸附试验进行检测。
2.2 观察指标 观察2组外周血中Treg细胞水平，即Treg细胞（CD4+CD25+Foxp3+T细胞）占CD4+T细胞的百分比;比较观察组不同28个关节疾病活动度评分（DAS28评分）患者的Treg细胞水平，按DAS28评分 < 2.6分、2.6～3.2分、3.3～5.1分、> 5.1分分为4组;比较2组IL-35水平;比较RA患者不同DAS28评分组的IL-35水平。
2.3 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料符合正态分布以表示，采用
t检验，不符合正态分布转换为正态分布后进行分析;计数资料采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
3 结 果
3.1 2组外周血中Treg细胞表达、Foxp3荧光强度比较 观察组外周血中Treg细胞表达高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）;2组Foxp3荧光强度比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。
3.2 2组外周血中IL-35水平比较 观察组外周血中IL-35水平较对照组低，差异有统计学意义
（P < 0.05）。见表2。
3.3 各DAS28评分组RA患者基线资料、Treg细胞表达、Foxp3荧光强度及IL-35水平比较 各DAS28评分组RA患者基线资料比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。不同DAS28评分患者Treg细胞表达比较，差异有统计学意义（P < 0.05），
且DAS28评分越高，Treg细胞表达越低。不同DAS28评分患者Foxp3荧光强度比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。不同DAS28评分患者IL-35水平比较，差异有统计学意义（P < 0.05），且DAS28评分越高，IL-35表达水平越低。见表3。
4 讨 论
RA常出现关节疼痛、僵硬、肿胀等症状，随着疾病的进展，对关节组织造成破坏，影响患者的日常活动。RA发病年龄为40～60岁，患病率为0.32%～0.36%。一般认为，RA与免疫耐受被破坏相关[6-7]。目前，RA的病因和发病机制尚不完全清楚。在健康人群CD4+T细胞中，外周血Treg细胞的比例为5%～10%。Treg细胞具有免疫负调控的作用，对机体自身免疫耐受的维持有重要的意义。Treg细胞的作用主要包括：①表达抑制性转录因子Foxp3;②分泌抑制性细胞因子，如IL-2、IL-10等;③细胞直接接触介导抑制。IL-35是IL-12的家族成员，机体中主要由Treg细胞产生IL-35。IL-12 P35亚基、P35亚基相同，IL-27 EBl3亚基、EBl3亚基相同。构成IL-35亚基的包括EBl3亚基、P35亚基。有研究显示，EBI3-P35-Fc融合蛋白抑制IL-17分泌、Thl7细胞分化，提升γ干扰素水平，促进CD4+CD25+Treg细胞增殖，抑制CD4+CD25-T细胞增殖，改善关节炎症状[8-9]。也有研究显示，由于缺乏IL-35，Treg细胞的抑制功能也会下降[10-13]。有IL-35缺陷的Treg细胞，发挥控制增殖效果，IL-35会抑制CD4+和CD8+ T细胞[14]。
本研究显示，相比健康人群，RA患者的Treg细胞数量明显增加（P < 0.05），但Treg细胞分泌的IL-35比健康人群明显更低（P < 0.05）。提示在RA患者中，IL-35表达下降。IL-35具有负向调控的作用，说明免疫耐受遭到破坏。处于免疫“无能”状态下，RA患者Treg细胞表达上升，免疫负调控功能没有发挥[15-16]。为进一步研究相关情况，对RA患者不同DAS28评分进行分组观察，结果显示，不同DAS28评分患者Treg细胞、IL-35水平比较，差异有统计学意义（P < 0.05）;且DAS28评分越高，Treg细胞数量越低，IL-35水平越低。DAS28评分显示RA病情活动度，DAS28评分越高，表示关节侵蚀较重，疾病活动度越高;DAS28评分越低，显示病情缓解。在疾病活动期一定程度上抑制了外周血Treg细胞数量及功能，机体处于免疫激活状态，降低了其负调控能力，IL-35表达水平也下降。DAS28评分越高，疾病活动度越高。在疾病恢复期，Treg细胞、IL-35功能提升，机体处于免疫抑制状态。RA病程与Treg细胞也有一定的相关性。有研究认为RA患者外周血Treg细胞以及Treg细胞分泌IL-35减少，也有研究认为没有明显变化[17-19]。出现差异的原因，可能是由于某些患者用药物治疗后，对自身抗原的免疫耐受重建，免疫功能改
善[20-23];也可能是不同病程、活动度的影响;也可能是试验样本群的影响。
综上所述，RA患者IL-35水平显著下降，Treg细胞水平提升，Treg细胞及分泌的IL-35与其发生、发展可能相关。
参考文献
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收稿日期：2021-03-09;修回日期：2021-04-21