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目的:分离培养及纯化人骨髓间充质干细胞,鉴定其表型与增殖特性。方法:实验于2006-11在上海复旦大学遗传工程国家重点实验室完成。①由上海浦东妇幼保健医院协助,骨髓标本采自因意外事故流产死亡的正常胎儿,产妇及其家属均签署知情同意书,实验经过医学伦理委员会批准。②无菌操作分离死亡2h内的胎儿下肢股骨、胫骨,贴壁筛选法分离培养胎儿骨髓间充质干细胞。细胞长满80%左右用胰酶消化传代,1∶4传于新的培养瓶中,原代培养结束。传代培养细胞长满后均按1∶3或1∶4传代,用a-MEM+胎牛血清+二甲基亚枫冻存备用。③倒置相差显微镜下观察原代及传代培养的人骨髓间充质干细胞的生长情况及形态变化。MTS法绘制细胞生长曲线,荧光激活细胞分选术鉴定细胞表面分子,流式细胞术检测细胞周期,Real-timePCR分析不同代次细胞转录因子oct-4的表达丰度。结果:①人骨髓间充质干细胞的生长情况及形态观察:接种48h后,贴壁细胞呈梭形、多角形成纤维细胞样形态,大小均一。传代培养细胞已看不到血细胞贴壁,形态更加均一,呈克隆样生长。传至18代后生长减慢,20代后出现胞浆空泡化、胞体变大等老化现象。②人骨髓间充质干细胞的生长曲线:细胞贴壁48h基本无增殖,处于潜伏期;对数增殖期为3～5d,第6天后进入平台期,细胞出现接触抑制现象。③人骨髓间充质干细胞表面标记鉴定:第2代人骨髓间充质干细胞纯度可达98%以上,其细胞表型CD29,CD90,CD166呈阳性表达,CD34,CD45呈阴性表达。④人骨髓间充质干细胞周期检测结果:培养的第2代人骨髓间充质干细胞82%以上处于G0/G1期,处于S期的细胞比例不到10%,8%左右的细胞处于G2/M期,保持了较高的增殖潜能。⑤转录因子oct-4在人骨髓间充质干细胞中的表达:oct-4在第3,7,12,18代人骨髓间充质干细胞中的表达丰度呈略下降的趋势(0.68±0.08,0.64±0.12,0.61±0.04,0.60±0.14),但第7,12,18代与第3代比较差异无显著性意义(P=0.65,P=0.27,P=0.41)结论:人骨髓间充质干细胞容易体外分离培养,增殖旺盛,普通条件能够保持间充质干细胞的特性,培养较长时间而不分化。