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摘 要：目的：建立高效液相色谱法测定大黄?虫丸中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的含量，并评价大黄?虫丸中黄曲霉毒素的安全性。方法：采用高效液相色谱柱后光化学衍生法，色谱柱为Intersil ODS-3 C18柱，流动相为甲醇-水，梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，荧光检测器，激发波长360 nm，发射波长450 nm。结果：黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2分别在10.2～51.0 pg（r=0.998 9）、4.3～21.5 pg（r=0.999 6）、10.6～53.0 pg（r=0.998 6）、3.8～19.0 pg（r=0.999 6）范围内，具有良好的线性关系，其加样回收率在83%～94%，RSD为1.56%～2.11%。有9批样品检出黄曲霉毒素，其总含量在0.2657～1.5805 μg/kg。结论：本方法专属性强，操作简单，结果稳定可靠，分离度好，可用于大黄?虫丸中黄曲霉毒素的质量控制。
关键词：大黄?虫丸;黄曲霉毒素;柱后光化学衍生法;高效液相色谱法
黄曲霉毒素是由黄曲霉和寄生曲霉中产毒菌株产生的一类致癌物质，可诱发肝、肾、肺、胃、结肠等部位的癌变，是目前为止发现的毒性最大的真菌毒素。黄曲霉毒素可以通过多种途径污染食品和饲料，直接或间接地进入食物链，从而威胁人们的健康和生命安全。目前有100多个国家已经制订了食品中黄曲霉的法规标准及检测方法，我国也已于2011年4月20日发布了《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2011），其规定了食品中黄曲霉毒素的限量指标。《中国药典》2005年版增补本收载了黄曲霉毒素的测定方法，并规定了部分品种的限量值[1]。
大黄?虫丸是由熟大黄、土鳖虫、水蛭、虻虫、桃仁、炒苦杏仁、黄芩、地黄、白芍、甘草等十二味药经粉碎、过筛和混匀制成的复方制剂。其功效是活血破瘀，通经消癥。常用于瘀血内停所致的癥瘕、闭经，症见腹部肿块、肌肤甲错、面色黯黑、潮热羸瘦、经闭不行[2]。《中国药典》2020年版一部对其中的土鳖虫、水蛭、桃仁的黄曲霉毒素进行了限量控制[2]。目前对大黄?虫丸安全性方面的研究尚未见报道，为进一步保证药品的安全性，本试验参照《中国药典》2020年版四部通则2351及有关文献资料[3-9]，采用高效液相色谱法柱后衍生法，对大黄?虫丸中黄曲霉毒素进行检测，以了解大黄?虫丸中黄曲霉毒素污染状况，并为临床安全用药提供数据资料。
1 仪器与方法
1.1 仪器
Waters e2695高效液相谱仪（带自动进样器、柱温箱、2475荧光检测器、Empower3工作站）;梅特勒-托利多XS303S电子分析天平（千分之一）;光化学衍生器Huirentek PHRED-HR;高速匀质机D-500（Made by Wiggens）;离心机TG16G（湖南凯达科学仪器有限公司）。
1.2 试剂
免疫亲和柱（ROMER，AflaStarTM R，Lot：1000004945）;黄曲霉毒素混合标准品溶液（中国食品药品检定研究院 610001-201602）;甲醇、乙腈均为色谱纯;Ⅰ级纯化水（自制）;其他试剂均为分析纯。大黄?虫丸（批号为20170908、20171112、20171217、20180503、20180810、20181109、20190505、20191202、20191211、20200610，由某制药公司生产）。
1.3 试验方法
1.3.1 色谱条件
色谱柱：Intersil ODS-3 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;柱温：30 ℃;流动相为甲醇-水，梯度洗脱（比例见表1），流速为1.0 mL/min;柱后衍生-光化学衍生法;荧光检测器，激发波长360 nm，发射波长450 nm，进样量20 μL。
1.3.2 溶液制备
（1）混合对照品溶液制备。取黄曲霉毒素混合标准品溶液（黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标示浓度分别为1.02 μg/mL、0.43 μg/mL、1.06 μg/mL、0.38 μg/mL）1.00 mL，加甲醇稀释至50.00 mL，作为储备液，量取储备液1.00 mL，加甲醇稀释至10.00 mL。
（2）供试品溶液制备。取供试品粉末15 g，置均质瓶中，加入氯化钠3 g，精密加入70%甲醇溶液75 mL，高速搅拌2 min（搅拌速度大于11 000 r/min），离心5 min（离心速度4 000 r/min），精密量取上清液15 mL，置50 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，离心5 min（离心速度4 000 r/min），取上清液20.00 mL，通过免疫亲和柱，流速3 mL/min，用20 mL水洗脱，弃去洗脱液，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再加2.00 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，用甲醇稀释至2.00 mL，摇匀，用微孔滤膜（0.22 μm）滤过，取滤液备用。
（3）阴性样品溶液制备。取检测无黄曲霉毒素的药材，按照药典制法制成大黄?虫丸样品，取样品15 g，同供试品方法制备，即得。
2 结果与分析
2.1 系统适应性试验
按照1.3.1的色谱条件，分别吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图（见图1）。由图1可知，黄曲霉毒素各组分完全分离（分离度大于1.5），阴性样品无干扰。
2.2 方法学考察
2.2.1 线性相关性考察
按照1.3.1的色谱条件，精密吸取1.3.2（1）的黄曲霉毒素混合对照品溶液5 μL、10 μL、15 μL、20 μL和25 μL进行测定，记录色谱图，以对照品量为横坐标（X，pg），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，结果见表2 2.2.2 精密度试验
按照1.3.1的色谱条件，吸取混合对照品溶液15 μL，进样6次，测定峰面积，结果表明，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的RSD分別为2.43%，1.86%，2.99%，2.05%，表明仪器的精密度良好。
2.2.3 稳定性试验
取供试品溶液（批号20191202）1.0mL，加入混合对照品溶液0.10 mL，分别制备2 h、4 h、6 h、12 h、16 h和24 h后，按照1.3.1的色谱条件进行测定，结果表明，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的RSD分别为2.03%，1.98%，2.69%，2.32%，表明供试品溶液在24 h内测定稳定。
2.2.4 重复性试验
取样品（批号20180810），按1.3.2（2）的方法，制备6份供试品溶液，按照1.3.1的色谱条件进行测定。结果表明，黄曲霉素B1的RSD为3.02%，黄曲霉毒素总量的RSD为4.12%，表明该方法重复性良好。
2.2.5 加样回收率试验
精密称取未检出黄曲霉毒素的样品约7.5 g（批号20181109），6份，分别加入1.3.2（1）的黄曲霉毒素混合对照品溶液储备液0.10 mL，按照1.3.2（2）的方法制备，按照1.3.1的色谱条件进行测定，计算黄曲霉毒素的RSD和回收率。结果表明，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的平均回收率分别为94%，86%，89%，83%;RSD分别为1.89%，1.56%，2.11%，2.03%（n=6）。
2.2.6 检测限和定量限试验
倍比稀释混合对照品溶液，在信噪比约为3时，测得黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的检测限分别为0.408 pg，0.172 pg，0.424 pg，0.152 pg;在信噪比约为10时，测得黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的定量限分别为1.346 pg，0.585 pg，1.421 pg，0.519 pg。
2.2.7 样品含量测定
取10批次样品，按照1.3.2（2）的方法制备供试品溶液，按照1.3.1的色谱条件进行测定，结果见表3。
3 结论
①本试验中，曾按《中国药典》一部方法选用甲醇-乙腈-水（40∶1842）作为流动相，分离效果不理性，样品中其他成分干扰大，最后选用甲醇-水为流动相进行梯度洗脱，各黄曲霉毒素峰分离效果好，其他成分无干扰。②对10批次样品进行检测，其中有9批中有黄曲霉毒素的检出，结果黄曲霉毒素B1的含量均少于1 μg/kg，黄曲霉毒素的总量均小于2 μg/kg，都低于药典规定的限度值（5 μg/kg，10 μg/kg）。表明大黄?虫丸安全性较好，但检出率高到90%，仍应重视黄曲霉毒素的检测。③本方法具有专属性强，操作简单，结果稳定可靠，分离度好等特点，可作为用于大黄?虫丸中黄曲霉毒素的含量测定的方法。④大黄?虫丸中的熟大黄、桃仁、炒苦杏仁、甘草等及主要辅料蜂蜜，有的属于药食同源，有的可用于保健食品。而本次试验中黄曲霉毒素的检出率极高，相关部门应反思其原料的安全性，尤其上述广泛作为食品使用的药材，进而保证广大消费者的饮食用药安全。
参考文献
[1]国家药典委员会.中国药典分析检测技术指南[M].北京：中国医药科技出版社，2017.
[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2020.
[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典（四部）[M].北京：中国医药科技出版社，2020.
[4]刘丽娜，李耀磊，金红宇，等.免疫亲和净化HPLC柱后光化学衍生荧光法测定动物药中黄曲霉毒素[J].中草药，2017，48（6）：1220-1224.
[5]黄晓燕，方磊，李荣玮，等.HPLC法测定小儿扶脾颗粒中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2含量[J].中国药师，2018，21（2）：334-336.
[6]栗建明，顾利红，隆颖.高效液相色谱柱后衍生法测定归脾丸中的黄曲霉毒素[J].今日药学，2017，27（7）：460-462.
[7]刘书宇，仇峰，杨美华.免疫亲和柱净化-在线柱后光化学衍生HPLC-FLD检测莲子中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2及其液质确认[J].中国中药杂志，2012，37（3）：305-309.
[8]宋晓宁，张志勇.香砂六君丸中的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的含量测定及安全性评价[J].时珍国医国药，2014，25（9）：2252-2253.
[9]魏莹，李文东，杨兰，等.高效液相色谱法柱后衍生法测定陈皮中黄曲霉毒素[J].中国药业，2015，24（24）：160-162.
关键词：大黄?虫丸;黄曲霉毒素;柱后光化学衍生法;高效液相色谱法
黄曲霉毒素是由黄曲霉和寄生曲霉中产毒菌株产生的一类致癌物质，可诱发肝、肾、肺、胃、结肠等部位的癌变，是目前为止发现的毒性最大的真菌毒素。黄曲霉毒素可以通过多种途径污染食品和饲料，直接或间接地进入食物链，从而威胁人们的健康和生命安全。目前有100多个国家已经制订了食品中黄曲霉的法规标准及检测方法，我国也已于2011年4月20日发布了《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2011），其规定了食品中黄曲霉毒素的限量指标。《中国药典》2005年版增补本收载了黄曲霉毒素的测定方法，并规定了部分品种的限量值[1]。
大黄?虫丸是由熟大黄、土鳖虫、水蛭、虻虫、桃仁、炒苦杏仁、黄芩、地黄、白芍、甘草等十二味药经粉碎、过筛和混匀制成的复方制剂。其功效是活血破瘀，通经消癥。常用于瘀血内停所致的癥瘕、闭经，症见腹部肿块、肌肤甲错、面色黯黑、潮热羸瘦、经闭不行[2]。《中国药典》2020年版一部对其中的土鳖虫、水蛭、桃仁的黄曲霉毒素进行了限量控制[2]。目前对大黄?虫丸安全性方面的研究尚未见报道，为进一步保证药品的安全性，本试验参照《中国药典》2020年版四部通则2351及有关文献资料[3-9]，采用高效液相色谱法柱后衍生法，对大黄?虫丸中黄曲霉毒素进行检测，以了解大黄?虫丸中黄曲霉毒素污染状况，并为临床安全用药提供数据资料。
1 仪器与方法
1.1 仪器
Waters e2695高效液相谱仪（带自动进样器、柱温箱、2475荧光检测器、Empower3工作站）;梅特勒-托利多XS303S电子分析天平（千分之一）;光化学衍生器Huirentek PHRED-HR;高速匀质机D-500（Made by Wiggens）;离心机TG16G（湖南凯达科学仪器有限公司）。
1.2 试剂
免疫亲和柱（ROMER，AflaStarTM R，Lot：1000004945）;黄曲霉毒素混合标准品溶液（中国食品药品检定研究院 610001-201602）;甲醇、乙腈均为色谱纯;Ⅰ级纯化水（自制）;其他试剂均为分析纯。大黄?虫丸（批号为20170908、20171112、20171217、20180503、20180810、20181109、20190505、20191202、20191211、20200610，由某制药公司生产）。
1.3 试验方法
1.3.1 色谱条件
色谱柱：Intersil ODS-3 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;柱温：30 ℃;流动相为甲醇-水，梯度洗脱（比例见表1），流速为1.0 mL/min;柱后衍生-光化学衍生法;荧光检测器，激发波长360 nm，发射波长450 nm，进样量20 μL。
1.3.2 溶液制备
（1）混合对照品溶液制备。取黄曲霉毒素混合标准品溶液（黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标示浓度分别为1.02 μg/mL、0.43 μg/mL、1.06 μg/mL、0.38 μg/mL）1.00 mL，加甲醇稀释至50.00 mL，作为储备液，量取储备液1.00 mL，加甲醇稀释至10.00 mL。
（2）供试品溶液制备。取供试品粉末15 g，置均质瓶中，加入氯化钠3 g，精密加入70%甲醇溶液75 mL，高速搅拌2 min（搅拌速度大于11 000 r/min），离心5 min（离心速度4 000 r/min），精密量取上清液15 mL，置50 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，离心5 min（离心速度4 000 r/min），取上清液20.00 mL，通过免疫亲和柱，流速3 mL/min，用20 mL水洗脱，弃去洗脱液，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再加2.00 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，用甲醇稀释至2.00 mL，摇匀，用微孔滤膜（0.22 μm）滤过，取滤液备用。
（3）阴性样品溶液制备。取检测无黄曲霉毒素的药材，按照药典制法制成大黄?虫丸样品，取样品15 g，同供试品方法制备，即得。
2 结果与分析
2.1 系统适应性试验
按照1.3.1的色谱条件，分别吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图（见图1）。由图1可知，黄曲霉毒素各组分完全分离（分离度大于1.5），阴性样品无干扰。
2.2 方法学考察
2.2.1 线性相关性考察
按照1.3.1的色谱条件，精密吸取1.3.2（1）的黄曲霉毒素混合对照品溶液5 μL、10 μL、15 μL、20 μL和25 μL进行测定，记录色谱图，以对照品量为横坐标（X，pg），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，结果见表2 2.2.2 精密度试验
按照1.3.1的色谱条件，吸取混合对照品溶液15 μL，进样6次，测定峰面积，结果表明，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的RSD分別为2.43%，1.86%，2.99%，2.05%，表明仪器的精密度良好。
2.2.3 稳定性试验
取供试品溶液（批号20191202）1.0mL，加入混合对照品溶液0.10 mL，分别制备2 h、4 h、6 h、12 h、16 h和24 h后，按照1.3.1的色谱条件进行测定，结果表明，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的RSD分别为2.03%，1.98%，2.69%，2.32%，表明供试品溶液在24 h内测定稳定。
2.2.4 重复性试验
取样品（批号20180810），按1.3.2（2）的方法，制备6份供试品溶液，按照1.3.1的色谱条件进行测定。结果表明，黄曲霉素B1的RSD为3.02%，黄曲霉毒素总量的RSD为4.12%，表明该方法重复性良好。
2.2.5 加样回收率试验
精密称取未检出黄曲霉毒素的样品约7.5 g（批号20181109），6份，分别加入1.3.2（1）的黄曲霉毒素混合对照品溶液储备液0.10 mL，按照1.3.2（2）的方法制备，按照1.3.1的色谱条件进行测定，计算黄曲霉毒素的RSD和回收率。结果表明，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的平均回收率分别为94%，86%，89%，83%;RSD分别为1.89%，1.56%，2.11%，2.03%（n=6）。
2.2.6 检测限和定量限试验
倍比稀释混合对照品溶液，在信噪比约为3时，测得黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的检测限分别为0.408 pg，0.172 pg，0.424 pg，0.152 pg;在信噪比约为10时，测得黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的定量限分别为1.346 pg，0.585 pg，1.421 pg，0.519 pg。
2.2.7 样品含量测定
取10批次样品，按照1.3.2（2）的方法制备供试品溶液，按照1.3.1的色谱条件进行测定，结果见表3。
3 结论
①本试验中，曾按《中国药典》一部方法选用甲醇-乙腈-水（40∶1842）作为流动相，分离效果不理性，样品中其他成分干扰大，最后选用甲醇-水为流动相进行梯度洗脱，各黄曲霉毒素峰分离效果好，其他成分无干扰。②对10批次样品进行检测，其中有9批中有黄曲霉毒素的检出，结果黄曲霉毒素B1的含量均少于1 μg/kg，黄曲霉毒素的总量均小于2 μg/kg，都低于药典规定的限度值（5 μg/kg，10 μg/kg）。表明大黄?虫丸安全性较好，但检出率高到90%，仍应重视黄曲霉毒素的检测。③本方法具有专属性强，操作简单，结果稳定可靠，分离度好等特点，可作为用于大黄?虫丸中黄曲霉毒素的含量测定的方法。④大黄?虫丸中的熟大黄、桃仁、炒苦杏仁、甘草等及主要辅料蜂蜜，有的属于药食同源，有的可用于保健食品。而本次试验中黄曲霉毒素的检出率极高，相关部门应反思其原料的安全性，尤其上述广泛作为食品使用的药材，进而保证广大消费者的饮食用药安全。
参考文献
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[5]黄晓燕，方磊，李荣玮，等.HPLC法测定小儿扶脾颗粒中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2含量[J].中国药师，2018，21（2）：334-336.
[6]栗建明，顾利红，隆颖.高效液相色谱柱后衍生法测定归脾丸中的黄曲霉毒素[J].今日药学，2017，27（7）：460-462.
[7]刘书宇，仇峰，杨美华.免疫亲和柱净化-在线柱后光化学衍生HPLC-FLD检测莲子中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2及其液质确认[J].中国中药杂志，2012，37（3）：305-309.
[8]宋晓宁，张志勇.香砂六君丸中的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的含量测定及安全性评价[J].时珍国医国药，2014，25（9）：2252-2253.
[9]魏莹，李文东，杨兰，等.高效液相色谱法柱后衍生法测定陈皮中黄曲霉毒素[J].中国药业，2015，24（24）：160-162.