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【摘 要】 目的：研究干扰MTDH基因表达对宫颈癌Hela细胞增殖和侵袭的影响及其作用机制。方法：构建MTDH shRNA表达质粒，将其转染Hela细胞并设置相应的对照组，Western-blot检测各组细胞中MTDH、VEGF-A、E-Cadherin蛋白表达情况；同时MTT法检测各组细胞增殖情况；Transwell检测各组细胞侵袭能力。结果：与对照组相比，MTDH干扰组Hela细胞中MTDH、VEGF-A蛋白表达明显下降，E-Cadherin蛋白表达显著上升。MTDH干扰组Hela细胞增殖受到明显抑制，且细胞侵袭能力显著下降。结论：干扰Hela细胞中MTDH基因表达能够下调VEGF-A表达并增强E-Cadherin的表达，从而抑制Hela细胞增殖及侵袭。
【关键词】 MTDH RNA干扰 宫颈癌 细胞增殖 细胞侵袭
宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤，对宫颈癌的基因治疗是值得探索的综合治疗手段之一，理想靶点的选择及有效的干预手段是基因治疗的重要基础。MTDH即metadherin，中文名为异黏蛋白，是近年来发现的一个比较新的癌基因。根据文献报道[1]，MTDH在宫颈癌、乳腺癌等多种肿瘤组织中高表达，显示其可能与多种肿瘤的发生、发展密切相关。研究显示，MTDH过度表达能够诱导肿瘤细胞异常增殖，提高肿瘤细胞的细胞侵袭能力，增强肿瘤细胞对化疗药物的耐药性，从而促进肿瘤的发展。因此MTDH可能是在很多肿瘤中进行基因治疗的理想靶点。
目前国内外已有研究者通过下调MTDH表达抑制肝癌、乳腺癌等肿瘤的发生及发展[2，3]，但将MTDH作为基因治疗靶点应用于宫颈癌治疗的相关报道很少。在宫颈癌细胞中抑制MTDH表达后，是否会对肿瘤细胞的增殖和侵袭能力造成影响，其具体作用机制如何，是值得研究的课题。因此本课题构建了MTDH shRNA质粒，利用其下调宫颈癌Hela细胞中MTDH表达，观察其对Hela细胞增殖和侵袭能力的影响，并对其中可能的作用机制进行了研究。
1 材料与试剂
MTDH shRNA表达质粒（pLV-MTDH-sh）及相应的对照质粒（pLV-shNC）购自长沙赢润生物技术有限公司。Hela细胞购自中科院上海细胞库。胎牛血清、DMEM培养基购自Gibco。Lip2000转染试剂购自Invitrogen。MTDH抗体、VEGF-A抗体、E-Cadherin抗体均购自CST。β-actin内参抗体、MTT检测试剂盒均购自长沙赢润生物技术有限公司。
2 方法
2.1 细胞培养及转染
用T25细胞培养瓶培养两瓶Hela细胞，利用Lip2000转染试剂将pLV-MTDH-sh、pLV-shNC质粒分别转染至Hela细胞中，48h后收细胞。
2.2 Western-blot检测
提取2.1中获得的各组细胞总蛋白，常规Western-blot方法检测各组细胞中MTDH、VEGF-A、E-Cadherin蛋白表达情况，以β-actin作为内参。
2.3 MTT检测细胞增殖
将Hela细胞分为两组，分别转染pLV-MTDH-sh、pLV-shNC质粒，于转染后24h、48h、72h用MTT检测试剂盒检测各组细胞增殖情况。
2.4 Transwell检测细胞侵袭能力
将Hela细胞分为两组，分别转染pLV-MTDH-sh、pLV-shNC质粒，48h后用Transwell法检测各组细胞侵袭能力。
3 结果
3.1 Western-blot检测MTDH、VEGF-A、E-Cadherin蛋白表达
Western-blot检测对照组及MTDH干扰组Hela细胞中MTDH、VEGF-A、E-Cadherin蛋白表达情况，结果显示与对照组相比，MTDH干扰组Hela细胞中MTDH、VEGF-A蛋白表达明显下降，而E-Cadherin蛋白表达显著上升（图1），差异有统计学意义（P<0.05）。
3.2 干扰MTDH基因表达对Hela细胞增殖的影响
MTT法检测对照组及MTDH干扰组Hela细胞增殖情况，结果显示与对照组相比，MTDH干扰组Hela细胞增殖受到显著抑制，细胞增殖抑制率最高可达12.23%（图2），差异具有统计学意义（P<0.05）。
3.3 干扰MTDH基因表达对Hela细胞侵袭能力的影响
Transwell法检测对照组及MTDH干扰组Hela细胞侵袭能力，结果显示MTDH干扰组Hela细胞侵袭能力下降为对照组的49.3%（图3），改变明显，差异有统计学意义（P<0.05）。
4 讨论
MTDH是近年来新发现的一个癌基因，在乳腺癌、宫颈癌等多种肿瘤中高表达，如王明娟等[4]发现宫颈癌组织中MTDH蛋白阳性表达率明显高于正常宫颈组织，认为MTDH与宫颈癌的发生、发展密切相关。因此，MTDH可能是在很多肿瘤中进行基因治疗的理想靶点。目前已有研究者报道通过下调MTDH表达抑制各种肿瘤的发生及发展，如刘兆喆等[5]利用shRNA干扰MTDH抑制乳腺癌细胞侵袭能力；李荣国等[6]利用mir-22下调胶质瘤细胞中MTDH蛋白表达，发现细胞生长受到明显抑制。但将MTDH作为基因治疗靶点应用于宫颈癌治疗的相关报道很少。因此，本课题针对干扰MTDH基因表达对宫颈癌Hela细胞增殖和侵袭的影响及其作用机制进行了初步研究。
本课题首先用RNA干扰技术抑制了宫颈癌Hela细胞中MTDH蛋白表达，然后针对Hela细胞增殖及细胞侵袭能力进行了检测。结果发现，Hela细胞中MTDH表达下调后，细胞增殖及细胞侵袭能力均受到了明显抑制，显示在宫颈癌细胞中亦可通过干扰MTDH表达来抑制肿瘤的发生和发展，MTDH可能能够作为潜在的靶点用于宫颈癌的基因治疗。 本课题同时发现，在Hela细胞中，MTDH表达下调后，VEGF-A蛋白表达亦随之下降，而E-Cadherin蛋白表达随之上升。VEGF-A是血管内皮生长因子VEGF家族成员之一，能够诱导肿瘤血管和淋巴管生成，为肿瘤生长提供更多的氧气和营养物质，从而促进肿瘤增殖[7]。E-cadherin能够抑制肿瘤细胞的转移，是EMT的重要指标之一。当其表达下降时，往往伴随着EMT的发生或发展，肿瘤细胞表型发生改变，侵袭转移能力随之增强[8]。由此可以推断，MTDH表达下调进而引起VEGF-A蛋白表达下降，从而降低Hela细胞增殖能力；而同时E-cadherin蛋白随之表达增加，导致EMT现象减弱，Hela细胞侵袭能力受到抑制。
综上所述，本课题发现干扰宫颈癌Hela细胞中MTDH基因表达后，可以明显抑制Hela细胞增殖及侵袭能力，且对其中作用机制进行了初步探讨，具有一定的理论和实践意义。
参考文献
[1] Tokunaga E， Nakashima Y， Yamashita N， et al. Overexpression of metadherin/MTDH is associated with an aggressive phenotype and a poor prognosis in invasive breast cancer[J]. Breast Cancer， 2014，21（3）：341-9
[2] 蔡义. MTDH基因沉默稳定转染乳腺癌细胞株的建立及其增殖侵袭能力的研究[D]. 衡阳：南华大学，2012
[3] Wang S， Shu JZ， Cai Y， et al. Establishment and characterization of MTDH knockdown by artificial MicroRNA interference - functions as a potential tumor suppressor in breast cancer[J]. Asian Pac J Cancer Prev， 2012，13（6）：2813-8
[4] 王明娟，齐洁敏，王闯等. 异黏蛋白在宫颈癌中的表达及意义[J]. 承德医学院学报，2014（4）：288-290
[5] 刘兆喆，曹恒，丁震宇等. 下调MTDH基因表达对乳腺癌细胞转移潜能影响机制研究[J]. 中华肿瘤防治杂志，2014，21（8）：575-579
[6] 李荣国，王剑，杨少陵. miR-22通过靶向MTDH抑制胶质瘤细胞的生长[J]. 中国癌症杂志，2014，24（6）：401-405
[7] X Wang，X Chen，J Fang， et al. Overexpression of both VEGF-A and VEGF-C in gastric cancer correlates with prognosis， and silencing of both is effective to inhibit cancer growth[J]. International Journal of Clinical & Experimental Pathology， 2013， 6（4）：586-597
[8] 邹琼. miRNA200家族成员参与TGF--β1诱导胆囊腺癌EMT的机制研究[D]. 长沙：中南大学，2014
【关键词】 MTDH RNA干扰 宫颈癌 细胞增殖 细胞侵袭
宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤，对宫颈癌的基因治疗是值得探索的综合治疗手段之一，理想靶点的选择及有效的干预手段是基因治疗的重要基础。MTDH即metadherin，中文名为异黏蛋白，是近年来发现的一个比较新的癌基因。根据文献报道[1]，MTDH在宫颈癌、乳腺癌等多种肿瘤组织中高表达，显示其可能与多种肿瘤的发生、发展密切相关。研究显示，MTDH过度表达能够诱导肿瘤细胞异常增殖，提高肿瘤细胞的细胞侵袭能力，增强肿瘤细胞对化疗药物的耐药性，从而促进肿瘤的发展。因此MTDH可能是在很多肿瘤中进行基因治疗的理想靶点。
目前国内外已有研究者通过下调MTDH表达抑制肝癌、乳腺癌等肿瘤的发生及发展[2，3]，但将MTDH作为基因治疗靶点应用于宫颈癌治疗的相关报道很少。在宫颈癌细胞中抑制MTDH表达后，是否会对肿瘤细胞的增殖和侵袭能力造成影响，其具体作用机制如何，是值得研究的课题。因此本课题构建了MTDH shRNA质粒，利用其下调宫颈癌Hela细胞中MTDH表达，观察其对Hela细胞增殖和侵袭能力的影响，并对其中可能的作用机制进行了研究。
1 材料与试剂
MTDH shRNA表达质粒（pLV-MTDH-sh）及相应的对照质粒（pLV-shNC）购自长沙赢润生物技术有限公司。Hela细胞购自中科院上海细胞库。胎牛血清、DMEM培养基购自Gibco。Lip2000转染试剂购自Invitrogen。MTDH抗体、VEGF-A抗体、E-Cadherin抗体均购自CST。β-actin内参抗体、MTT检测试剂盒均购自长沙赢润生物技术有限公司。
2 方法
2.1 细胞培养及转染
用T25细胞培养瓶培养两瓶Hela细胞，利用Lip2000转染试剂将pLV-MTDH-sh、pLV-shNC质粒分别转染至Hela细胞中，48h后收细胞。
2.2 Western-blot检测
提取2.1中获得的各组细胞总蛋白，常规Western-blot方法检测各组细胞中MTDH、VEGF-A、E-Cadherin蛋白表达情况，以β-actin作为内参。
2.3 MTT检测细胞增殖
将Hela细胞分为两组，分别转染pLV-MTDH-sh、pLV-shNC质粒，于转染后24h、48h、72h用MTT检测试剂盒检测各组细胞增殖情况。
2.4 Transwell检测细胞侵袭能力
将Hela细胞分为两组，分别转染pLV-MTDH-sh、pLV-shNC质粒，48h后用Transwell法检测各组细胞侵袭能力。
3 结果
3.1 Western-blot检测MTDH、VEGF-A、E-Cadherin蛋白表达
Western-blot检测对照组及MTDH干扰组Hela细胞中MTDH、VEGF-A、E-Cadherin蛋白表达情况，结果显示与对照组相比，MTDH干扰组Hela细胞中MTDH、VEGF-A蛋白表达明显下降，而E-Cadherin蛋白表达显著上升（图1），差异有统计学意义（P<0.05）。
3.2 干扰MTDH基因表达对Hela细胞增殖的影响
MTT法检测对照组及MTDH干扰组Hela细胞增殖情况，结果显示与对照组相比，MTDH干扰组Hela细胞增殖受到显著抑制，细胞增殖抑制率最高可达12.23%（图2），差异具有统计学意义（P<0.05）。
3.3 干扰MTDH基因表达对Hela细胞侵袭能力的影响
Transwell法检测对照组及MTDH干扰组Hela细胞侵袭能力，结果显示MTDH干扰组Hela细胞侵袭能力下降为对照组的49.3%（图3），改变明显，差异有统计学意义（P<0.05）。
4 讨论
MTDH是近年来新发现的一个癌基因，在乳腺癌、宫颈癌等多种肿瘤中高表达，如王明娟等[4]发现宫颈癌组织中MTDH蛋白阳性表达率明显高于正常宫颈组织，认为MTDH与宫颈癌的发生、发展密切相关。因此，MTDH可能是在很多肿瘤中进行基因治疗的理想靶点。目前已有研究者报道通过下调MTDH表达抑制各种肿瘤的发生及发展，如刘兆喆等[5]利用shRNA干扰MTDH抑制乳腺癌细胞侵袭能力；李荣国等[6]利用mir-22下调胶质瘤细胞中MTDH蛋白表达，发现细胞生长受到明显抑制。但将MTDH作为基因治疗靶点应用于宫颈癌治疗的相关报道很少。因此，本课题针对干扰MTDH基因表达对宫颈癌Hela细胞增殖和侵袭的影响及其作用机制进行了初步研究。
本课题首先用RNA干扰技术抑制了宫颈癌Hela细胞中MTDH蛋白表达，然后针对Hela细胞增殖及细胞侵袭能力进行了检测。结果发现，Hela细胞中MTDH表达下调后，细胞增殖及细胞侵袭能力均受到了明显抑制，显示在宫颈癌细胞中亦可通过干扰MTDH表达来抑制肿瘤的发生和发展，MTDH可能能够作为潜在的靶点用于宫颈癌的基因治疗。 本课题同时发现，在Hela细胞中，MTDH表达下调后，VEGF-A蛋白表达亦随之下降，而E-Cadherin蛋白表达随之上升。VEGF-A是血管内皮生长因子VEGF家族成员之一，能够诱导肿瘤血管和淋巴管生成，为肿瘤生长提供更多的氧气和营养物质，从而促进肿瘤增殖[7]。E-cadherin能够抑制肿瘤细胞的转移，是EMT的重要指标之一。当其表达下降时，往往伴随着EMT的发生或发展，肿瘤细胞表型发生改变，侵袭转移能力随之增强[8]。由此可以推断，MTDH表达下调进而引起VEGF-A蛋白表达下降，从而降低Hela细胞增殖能力；而同时E-cadherin蛋白随之表达增加，导致EMT现象减弱，Hela细胞侵袭能力受到抑制。
综上所述，本课题发现干扰宫颈癌Hela细胞中MTDH基因表达后，可以明显抑制Hela细胞增殖及侵袭能力，且对其中作用机制进行了初步探讨，具有一定的理论和实践意义。
参考文献
[1] Tokunaga E， Nakashima Y， Yamashita N， et al. Overexpression of metadherin/MTDH is associated with an aggressive phenotype and a poor prognosis in invasive breast cancer[J]. Breast Cancer， 2014，21（3）：341-9
[2] 蔡义. MTDH基因沉默稳定转染乳腺癌细胞株的建立及其增殖侵袭能力的研究[D]. 衡阳：南华大学，2012
[3] Wang S， Shu JZ， Cai Y， et al. Establishment and characterization of MTDH knockdown by artificial MicroRNA interference - functions as a potential tumor suppressor in breast cancer[J]. Asian Pac J Cancer Prev， 2012，13（6）：2813-8
[4] 王明娟，齐洁敏，王闯等. 异黏蛋白在宫颈癌中的表达及意义[J]. 承德医学院学报，2014（4）：288-290
[5] 刘兆喆，曹恒，丁震宇等. 下调MTDH基因表达对乳腺癌细胞转移潜能影响机制研究[J]. 中华肿瘤防治杂志，2014，21（8）：575-579
[6] 李荣国，王剑，杨少陵. miR-22通过靶向MTDH抑制胶质瘤细胞的生长[J]. 中国癌症杂志，2014，24（6）：401-405
[7] X Wang，X Chen，J Fang， et al. Overexpression of both VEGF-A and VEGF-C in gastric cancer correlates with prognosis， and silencing of both is effective to inhibit cancer growth[J]. International Journal of Clinical & Experimental Pathology， 2013， 6（4）：586-597
[8] 邹琼. miRNA200家族成员参与TGF--β1诱导胆囊腺癌EMT的机制研究[D]. 长沙：中南大学，2014